Determinar la utilidad de la citometría de imagen en los cambios fibroquísticos
de la mama (CFQ) para evaluar el subsiguiente riesgo de desarrollar un carcinoma
de mama. Se seleccionaron los casos diagnosticados como CFQ por Punción Aspiración
con Aguja Fina (PAAF) sin cambios proliferativos (500 casos), también clasificados
como Tipo 1 (CFQ·1). Tras reprocesar las preparaciones para la citometría, 62
casos reunían las condiciones necesarias, practicándose 97 estudios de ADN,
ya que las células ductales y las apocrinas se analizaron por separado. Los
parámetros citométricos considerados han sido: ploidía, pico G0/G1, Fracción
de la Fase S, 5cER, 2cDI, y Coeficiente de Variación (CV). Tras 15 años de seguimiento
se formaron 2 grupos:
- Patología Simple (PS): pacientes con CQF·1 únicamente.
- Patología Asociada (PA): CQF·1 junto con cáncer de mama.
Se ha probado que las células ductales son diploides mientras que las apocrinas son tetraploides. Se ha calculado la relación estadística de los casos con CFQ·1 que además presentaban cáncer, construyendo una cohorte histórica y aplicando medidas de asociación, obteniendo un Riesgo Relativo = 0,7; por tanto es imposible confirmar una relación causa-efecto entre CQF·1 y cáncer de mama para p<0.01.
Los resultados prueban que la Citometría de Imagen aplicada sobre muestras obtenidas por PAAF es un método muy eficaz, rápido y relativamente no invasivo, para demostrar un aumento de la actividad y por tanto un mayor riesgo de desarrollar cáncer en los cambios fibroquísticos no proliferativos, y en consecuencia realizar un seguimiento más estrecho de estas pacientes. Por otro lado las células apocrinas son tetraploides, permaneciendo el resto de los índices de ADN dentro de los valores normales.
Durante los últimos años la citología por punción aspiración con aguja fina se ha convertido en una técnica esencial en la práctica clínica diaria. Hoy en día la utilidad de estos métodos es incuestionable y supone un método de diagnóstico poco invasivo en los pacientes previo a la cirugía y al establecimiento de un pauta terapéutica.
Son muy numerosos los trabajos encaminados a establecer una guía para el tratamiento del cáncer basados en un pronóstico previo a través de métodos cuantitativos(1,3,6,17,18,25,26,29,30,34), bien por citometría de imagen o de flujo. En España tambien se encuentran investigaciones apuntando en la misma línea(10,15,20,33). Conociendo la utilidad de éstas técnicas en cáncer, nosotros hemos querido aplicarlas sobre patología benigna (13) para predecir una evolución hacia la benignidad o la malignidad. De este modo hemos seleccionado los casos diagnosticados como cambios fibroquísticos, aunque excluyendo los cambios atípicos o con hiperplasias, ya que su relación con el cáncer está bien establecida(11).
Las referencias bibliográficas acerca de la citometía practicada en CFQ·1 son muy limitadas(8), no encontrando trabajos que relacionen sus hallazgos con una evolución pronóstica, en el sentido de cuantificar el riesgo de un posterior desarrollo de cáncer de mama basado en el análisis de la ploidía. Stomper (31) y Lo (19) trabajaron con citometría de flujo, más tarde Sarker (27) describió la utilidad del material obtenido por PAAF para la citometría de imagen. El estudio del ADN por citometría de imagen para lesiones benignas de la mama fue introducida por Seigneurin (28) y Sarker (27), pero no aplicándola como herramienta para estimar el riesgo de malignidad subyacente a los CFQ·1.
Este trabajo nace de nuestra preocupación por alcanzar un diagnóstico precoz del cáncer, antes aún de que los cambios arquitecturales estén presentes, es decir ¿ es posible detectar alteraciones en el ADN celular cuando no existen todavía alteraciones morfológicas?. Considerando el nivel actual de conocimientos en este campo creemos que sí es factible detectar aneuploidía en lesiones aparentemente benignas y así determinar un mayor riesgo de desarrollar lesiones malignas.
Selección de pacientes: Se estudiaron las PAAF procedentes de 3500 casos de
nuestros archivos, seleccionando aquellas diagnosticadas de CFQ·1 siguiendo
los criterios establecidos por Tavassoli (32) para separar
sólo los clasificados como Enfermedad No Proliferativa de la mama:
- poca celularidad con fragmentos de estroma o tejido adiposo.
- monocapas o nidos de células epiteliales, mezcladas con células mioepiteliales.
- células apocrinas y células espumosas.
estos casos también están incluidos en el Tipo I de la clasificación del Comité de Cáncer del Colegio de Patólogos Americanos (16), se reunen un total de 500 casos, de los cuales más de la mitad fueron rechazados para nuestro estudio ya que el seguimiento era inferior a 15 años, o fue imposible localizar a las pacientes para seguir su evolución. Todas las preparaciones fueron reprocesadas, desteñidas y reteñidas con hematoxilina progresiva de Gill, tinción que ha demostrado sobradamente su utilidad para la citometría, siendo más práctico su uso rutinario en un laboratorio que la tinción de Feulgen, como ha sido establecido por diferentes autores y por nosotros mismos a lo largo de nuestra experiencia en el campo de la Citometría de imagen. Tras este proceso 62 casos fueron considerados aptos para cuantificar dado que el resto no presentaba las condiciones mínimas (poca celularidad, mala fijación, preparaciones muy antiguas, mala conservación del material celular). La cuantificación de ADN se realizó por medio de citometría de imagen sobre las células ductales y sobre las células apocrinas, de este modo se llevaron a cabo un total de 97 evaluaciones.
Tras 15 años de seguimiento se formaron dos grupos:
- Patología Simple (PS): Diagnóstico de CFQ·1 únicamente.
- Patología Asociada (AP): CFQ·1 más cáncer de mama.
Ambos han sido estudiados por separado y después comparados aplicando el test de Mann Whitney (medida no paramétrica).
Para el estudio de PA se han revisado las historias médicas de 240 pacientes con cáncer de mama buscando las que presentaran asociada una enfermedad fibroquística. Sólo 27 mujeres tenían ambas patologías, y de éstas tan solo 8 tuvieron CFQ·1 antes del cáncer en el mismo pecho. El ADN fue analizado en 17 casos, la diferencia entre el número de casos y el de cuantificaciones estriba en la imposibilidad de evaluar material escaso o mal conservado. El porcentaje de casos válidos (53%) para su cuantificación es similar al encontrado por nosotros 4,5 en trabajos previos realizados bajo las mismas condiciones de estudio y obtención de material.
Muestras citológicas: una vez que los pacientes diagnosticados de CFQ·1 han sido seleccionados, revisamos las muestras archivadas una por una, escogiendo solo las teñidas con la técnica de Papanicolau. La técnica de tinción usando los métodos de Papanicolau o May-Grünwald-Giemsa es un procedimiento de rutina para material procedente de PAAF. La diferencia más importante entre ellas reside en el tipo de fijación ya que mientras que para el primer caso se hace en alcohol, en el segundo se deja secar al aire. Este cambio en la fijación (húmedo-seco) provoca grandes diferencias en el tamaño celular, siendo de mucho mayor tamaño en las preparaciones secadas al aire, por este motivo no deben ser usadas en conjunto, por lo tanto nosotros elegimos las muestras fijadas en alcohol, reprocesándolas completamente para poder practicar la citometría de imagen sobre ellas.
Los muestras citológicas procedentes de PAAF fueron dividas según la presencia o ausencia de metaplasia apocrina, para realizar la cuantificación de ADN sobre ambas poblaciones celulares del mismo caso y poder compararlas más adelante. Así en las figuras 1 y 2 se observan los dos tipos celulares, tal y como aparecen en la pantalla de nuestro ordenador tras seleccionar el campo más adecuado.
Características del material usado para la citometría y el estudio epidemiológico: Se utilizó un microscopio Olympus BH-2, captando los núcleos celulares a través de una lente 40x. La cámara de vídeo empleada ha sido una Sony CCD en blanco y negro, ya que vamos a comparar escalas de grises. Se trabajó con un PC de 32 megabits de memoria RAM, procesador Pentium II y 1 gigabyte de disco duro, a través del sistema informático TEXCAN desarrollado por O. Ferrer (14) se analizaron diferentes parámetros: ploidía, pico G0/G1 de núcleos diploides, Fracción de la fase S, 5cER, 2cDI y Coeficiente de Variación (CV), todos ellos calculados automáticamente por nuestro programa de citometría (TEXCAN):
Para calcular el pico G0-G1, comparamos la ploidía del pico modal con respecto a la considerada normal de las células control. La evaluación de la ploidía en la cantidad de ADN se calcula como la cuantificación del pico G0-G1 expresado en Unidades Aleatorias (UA) multiplicado por dos, dividido entre la cuantificación de la población control en UA.
Se considera diploide o poliploide cuando la moda del pico G0-G1 cae dentro del rango ± 2 desviaciones estándar del control, o sus múltiplos exactos, y aneuploide cuando se halla fuera de este rango.
El programa TEXCAN contiene los algoritmos para el cálculo de determinados índices pronósticos en su menú de Clasificación Automática. Han sido particularmente diseñados para el cáncer de mama considerando el valor de los parámetros clásicos
Conociendo esta información el programa genera siete índices pronósticos de los cuales solamente dos muestran unos valores exclusivamente dependientes de la cuantificación, como son el 5cER (5c exceeding rate) y el valor de la Entropía. El 5cER es el porcentaje de células que se encuentran por encima del valor 5c de DOI del histograma. La Entropía o dispersión del histograma es indicativa de si el histograma es o no poliploide y muy expansivo, sus valores oscilan entre 0 y 5 y fue descrito por Stenkvist en 1990, pero desde entonces su significado ha sido muy cuestionado y como la mayoría de los autores, nosotros hemos optado por no considerarla como variable de interés en nuestros estudios. Estos dos valores los podemos considerar objetivos, si bien siempre existe una cierta subjetividad en el momento de la captación de células, este factor está paliado por la suficiencia de la muestra.
El programa nos ofrece otros índices y grados de malignidad:
- El MPI o Indice Pronóstico Morfométrico de Baak (Morphometric Prognostic Index),
calculado como 0'3341 x raíz cuadrada del MAI + 0'2342 x tamaño del tumor en
cm - 0'7654 x estatus ganglionar donde 1 es positivo y 2 es negativo.
- El Indice de Malignidad (MI) de Böcking (Malignancy Index), calculado como
2cDI x 5cDI y cuyos valores están entre 0 y 4 si están normalizados. Siendo
2cDI la desviación estándar del valor 2c del histograma.
- El Grado de Malignidad (MG) de Böcking (Malignancy Grade), calculado como
3 x (Log. MI+1)/Log.3758 y cuya escala oscila entre 0 y 3.
- El balance de la ploidía (PB), calculado como la diferencia existente entre
el porcentaje de células euploides y fuera del rango de euploide tanto si son
aneuploides como poliploides.
Estos índices, están basados en parámetros histológicos, como son el tamaño del tumor, el índice de actividad mitótica (MAI) (Mytotic Activity Index) y la existencia o no de ganglios afectados. Es evidente que si nuestras muestras se refieren a punciones "in vivo" de un tumor, el tamaño del mismo, apreciado por palpación, variará con respecto al corte microscópico de la pieza. La existencia o no de ganglios afectados será también distinta y no disponemos de un MAI. Por todo esto no hemos tomado en consideración estos factores. Todas las preparaciones siguieron el mismo proceso, con las mismas condiciones de tinción e igual técnica de cuantificación de ADN. Como células de referencia se usaron controles internos -células del estroma- con una desviación máxima del 3% (CV<3%), como indica el "Consensus Report on Standardization of Diagnostic DNA Image Cytometry". Las células epiteliales ductales y la metaplasia apocrina fueron estudiadas por separado, usando los mismos controles internos, y siguiendo exactamente el mismo proceso; así pues, más de 12000 células fueron analizadas. Para realizar el correspondiente análisis epidemiológico se trabajó con el programa informático SpssWin versión 6.1.2, que procesa todos los datos y junto a la necesaria colaboración de un experto en estadística se integran los resultados alcanzando un profundo análisis matemático.
Figura 3: Histograma de Células Control.
Siendo estrictos diploidía, tetraploidía, etc. deberían referirse exclusivamente para casos en los que los valores de ploidía están incluidos entre el 0.25 previo y el 0.25 siguiente, clasificando al resto como cercanos (C) a la ploidía. En nuestro estudio hemos considerado para la evaluación no sólo el máximo valor de la ploidía sino también el 5cER y el 2cDI (calculado como la razón del pico G0G1 de los problemas frente al G0G1 de los controles diploides), así ploidías de ± 0.3 han sido aceptados como diploides. De cualquier modo en el grupo PS la ploidía media ha sido de 2.3 para las ductales y de 4.2 para la metaplasia apocrina, mientras que en para PA, la ploidía fue de 2.2 y 4.1 respectivamente, es decir, se ha comprobado que las células ductales son diploides y las apocrinas tetraploides (Figuras 4 y 5)
La proporción del pico G0/G1 para los núcleos diploides fue del 100% en todos los casos, lo que implica que no existió Fase S en ningún caso del grupo SP. En la muestra PA aparecieron valores muy similares a los de PS (como se ve para la ploidía), ambas muestras presentaron histogramas parecidos sin existir diferencias significativas; el estudio del ADN practicado sobre PA mostró un análisis euploide en todos los casos, no encontrando características de malignidad, aunque como se observa en la Tabla I, hay un pequeño porcentaje de células en Fase S, junto con un ligero aumento en los otros parámetros analizados, lo que implica un leve incremento, de media, en la actividad de esos cambios fibroquísticos; simplificando, las cuantificaciones de este grupo demuestran un aumento en la actividad cíclica del histograma superior a la esperada para los CFQ·1
Tabla I: Parámetros de la cuantificación.
Valoración estadística y estudio epidemiológico: considerando los valores de la ploidía para PS y PA, diferenciando células ductales y metaplasia apocrina, efectuamos los test estadísticos apropiados para comprobar si las muestras siguen una distribución normal. Así, dos medidas fueron aplicadas, Kurtosis y Skewness demostrando una distribución no normal, que requiere unos test estadísticos especiales. Por tanto, se aplicó el test de Mann-Whitney para muestras no paramétricas, que sirve para comparar dos muestras con respecto a su tamaño general, basado en estratificar las observaciones -ambas muestras combinadas- y luego comparar las medias de las dos muestras.
Se comprueba que las células ductales son diploides mientras que las apocrinas son tetraploides, con una significación estadística en ambas muestras de p<0.05. Como complemento a nuestra investigación aplicamos el test de Pearson (2) para comprobar si ambas poblaciones celulares siguen una correlación lineal. La meta de este test es estimar o predecir el valor de Y (apocrinas) correspondiente a un valor conocido de X (ductales); en nuestro trabajo esto significaría que para una variación conocida en una población celular se podría inferir el mismo cambio para la otra. El valor del coeficiente fue de 0,7 con p>0,05, lo que indica que la relación lineal entre ambas variables existe, aunque la significación estadística no alcanza el valor necesario para que pueda considerarse definitiva. (Tabla II y Figura 6)
Para el estudio epidemiológico calculamos la razón estadística entre las pacientes con CFQ·1 que desarrollaron cáncer posteriormente en la misma mama (8 casos) y un segundo cálculo para aquellos casos de aparición de carcinoma incluyendo la mama contralateral (8+19= 27 casos). En nuestro trabajo se halló cáncer de mama en un 5.4% de los CFQ·1, resultado muy similar a los obtenidos por otros autores (22), pero sensiblemente inferior al esperado para la población general que ha sido establecido en 11% (32) según diversos trabajos. Aplicamos un estudio de Cohortes Históricas2 que constituye el método central en epidemiología para el estudio de la relación entre características personales o exposiciones y la aparición de sucesos relacionados con la salud, y la identificación de hipótesis y estrategias de prevención de las enfermedades. De tal forma que aplicamos Medidas de Asociación representadas por el Riesgo Relativo (RR) (2), que es la relación entre el riesgo de enfermar en la cohorte expuesta (CFQ·1) sobre un intervalo definido de riesgo de enfermar en la cohorte no expuesta. El RR obtenido fue de 0.2 para los cánceres homolaterales y de 0,7 para los de cualquier localización. Este resultado se encuentra dentro del rango de los hallazgos de otros autores, pero hay una importante carencia de estudios relacionando el análisis epidemiológico con la investigación citométrica. En nuestro trabajo estos métodos han sido empleados y más tarde comparados mostrando una total concordancia.
Muchos trabajos en la literatura reciente han establecido claramente la relación
entre los cambios fibroquísticos de la mama y el riesgo de cáncer, pero como
indicó Page (23) pequeños grados de hiperplasia (proliferación
epitelial menor de 4 células de profundidad) son extremadamente comunes y no
constituyen un factor de riesgo. Para Dupont-Page (11)
el riesgo de desarrollar cáncer de mama es muy bajo para CFQ con pequeña o inexistente
hiperplasia comparado con el riesgo observado en las mujeres del "Third National
Cancer Survey". En su estudio, las pacientes con cambios no proliferativos y
sin historia familiar de cáncer, tenían un riesgo relativo de 0.86.El Comité
de Cáncer del Colegio de Patólogos Americanos (16) subdivide
a las mujeres con enfermedad benigna de la mama en tres categorías de riesgo,
comparadas con mujeres que no tienen biopsias:
1.- No aumento de riesgo
2.- Pequeño aumento del riesgo
3.- Moderado aumento del riesgo
Por lo tanto, los CFQ·1 con quistes apocrinos y poca hiperplasia epitelial fueron incluidos por el citado Comité dentro de la categoría 1.
Mongeau (22) encontró cáncer de mama en sólo el 5% de las lesiones de la categoría 1, y estableció que el riesgo de posterior aparición de carcinoma en pacientes con CFQ·1 es similar al de la población general; por lo tanto no es necesario un especial seguimiento es éstas mujeres. Respecto a la metaplasia apocrina, autores como Welling (35) y Page (24) afirmaron que cuando las áreas de hiperplasia muestran una metaplasia apocrina pura los cambios no reflejan un factor de riesgo, particularmente si la hiperplasia está confinada a pequeños nidos.
Los resultados obtenidos en nuestro estudio se encuentran dentro del rango de los descritos en la literatura, como se ha visto anteriormente. El valor del riesgo relativo (RR= 0.7) es ligeramente inferior, aunque reproduciendo la misma significación estadística, que el hallado por Dupont-Page. Así pues, teniendo en cuenta que un valor de RR<1 indica ausencia de riesgo (para algunos epidemiólogos incluso factor de protección) es imposible afirmar la existencia de una relación causa-efecto entre la CFQ·1 y el cáncer para una P<0.01.
El posterior desarrollo de carcinoma en las lesiones Tipo I es prácticamente el mismo (5,4%) que el calculado por Mongeau. La importancia de nuestro trabajo reside en el estudio tanto de la citometría de imagen como de la investigación epidemiológica, integrando y comparando ambos resultados, para obtener de este modo una nueva y más profunda visión de los CFQ·1.
Las referencias bibliográficas acerca de la citometía practicada en CFQ·1 son muy limitadas8, no encontrando ninguno que relacione sus resultados con el pronóstico de esas lesiones, en el sentido de cuantificar el riesgo de un posterior desarrollo de cáncer de mama basado en el análisis de la ploidía. Stomper (31) y Lo (19) llevaron a cabo sus trabajos con citometría de flujo, más tarde Sarker (27) describió la utilidad del material obtenido por PAAF en lesiones benignas de la mama para la citometría de imagen. La cuantificación por citometría de imagen para estos casos fue introducida por Seigneurin (28) y Sarker (27), pero no aplicándola como herramienta para estimar el riesgo de malignidad subyacente a los CFQ·1. Enchev (12) describió variaciones de la ploidía (hiperploidía) en las células metaplásicas apocrinas, sin embargo no estableció su tetraploidía, como hemos demostrado en este estudio.
Aun cuando se ha establecido claramente el bajo riesgo de progresión a cáncer de éstas lesiones, proponemos la realización de citometría de imagen para detectar esos casos en los que una mayor actividad del histograma de la ploidía sugiere un aumento en el riesgo de posterior desarrollo de lesiones malignas, y así poder establecer una mejor pauta de actuación preventiva.
En conclusión, nuestros resultados prueban que la Citometría de Imagen aplicada sobre muestras obtenidas por PAAF es una método muy eficaz, rápido y relativamente no invasivo, para demostrar un aumento de la actividad y por tanto un mayor riesgo de desarrollar cáncer en los cambios fibroquísticos no proliferativos , y en consecuencia realizar un seguimiento más estrecho de estas pacientes. Por otro lado las células apocrinas presentan un histograma tetraploide, permaneciendo el resto de los parámetros estudiados dentro de la normalidad.
