Primer Congreso Virtual Iberoamericano de Neurología  Barra de Navegación

COMUNICACION NUMERO 56


 

TITULO

EFECTOS “IN VITRO” DE NEUROTÓXICOS AMBIENTALES SOBRE NEURONAS AChE+

 

AUTORES

M.A. Capó, M. Palencia, J.M. Delgado y M.C. Sandoval.

Dpto. Toxicología y Farmacología. Fac. Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. Avda. Puerta de Hierro, s/n. 28040-Madrid.

Dirección de correo electrónico: ancap@eucmos.sim.ucm.es

 


TITULO |  AUTORES |  RESUMEN |  INTRODUCCION
MATERIAL Y METODOS | RESULTADOS | ICONOGRAFIA |  DISCUSION Y CONCLUSIONES
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RESUMEN

Dentro de la Neurotoxicología uno de los procesos importantes es conocer la patogenia de los tóxicos; el objetivo señalado es conocer el mecanismo de acción toxicológico del etilenglicol, del metilmercurio y del beta-aminopropionitrilo de forma comparativa. Se realizaron cultivos de hemisferios cerebrales de embrión de rata Wistar de 14 días. Para el cultivo se empleó medio DMEM suplementado con 20% de suero bovino fetal y con antibiótico (penicilina/estreptomicina). A los tres días de cultivo fueron añadidas concentraciones de 10-4 a 10-6 M, de etilenglicol, de metilmercurio y de beta-aminopropionitrilo. A las 24 horas de incubación fueron fijadas y observadas las alteraciones morfológicas. Para determinar los efectos sobre las neuronas AChE+ se utilizó el método de Karnowsky y Roots. A concentraciones de 10-4 M, tanto el metilmercurio como el etilenglicol producían destrucción masiva de células; a dosis de 10-5 M, el efecto era manifiesto sobre células AChE+ con el metilmercurio y el etilenglicol, menor con el beta-aminopropionitrilo, y a dosis de 10-6 M, los efectos disminuyeron, pero persiste la acción de los tres tóxicos sobre las neuronas AChE+. Podemos concluir que los tres tóxicos actúan selectivamente sobre las células neuronales AChE+ provocando una persistencia de acetilcolina que explicaría la patogenia de dichos tóxicos y con una escala de mayor a menor toxicidad señalaríamos, metilmercurio, etilenglicol y beta-aminopropionitrilo.

 

INTRODUCCION

Conocer la patogenia de los tóxicos ha sido siempre un proceso importante dentro de la Neurotoxicología. Debido al desarrollo industrial masivo la población está expuesta a numerosos compuestos químicos como etilenglicol, metilmercurio y beta-aminopropionitrilo. Estos neurotóxicos ambientales son utilizados con frecuencia, así el etilenglicol es un compuesto empleado como disolvente de pinturas y nitrato de celulosa, como electrolito se utiliza en condensadores, lociones capilares, anticongelantes y saborizantes. Compuestos orgánicos mercuriales como el metilmercurio se emplea en pesticidas y fungicidas, mientras que el beta-aminopropionitrilo es un péptido que se encuentra en las leguminosas.

Estos compuestos producen alteraciones a nivel del sistema nervioso central, así Ressler y cols. observaron que la administración de beta-aminopropionitrilo a ratas macho jóvenes durante 3-5 días producía hiperirritabilidad, temblores y convulsiones. La intoxicación con etilenglicol da lugar a fracaso renal, hipocalcemia y alteraciones neuronales. La exposición a metilmercurio produce efectos neurotóxicos más evidentes en el cerebro fetal, la intoxicación aguda por este compuesto provoca alteraciones sensitivas y motoras, de la expresión oral y del desarrollo cerebral.

El objetivo de este estudio es comparar el efecto tóxico que estos tres neurotóxicos ambientales producen sobre cultivos celulares neuronales de embrión de rata con el fin de establecer el grado de toxicidad que estos compuestos tienen a nivel del sistema nervioso central.

 

MATERIAL Y METODOS

El estudio se llevó a cabo en cultivos celulares neuronales obtenidos a partir de embriones de ratas Wistar de 14 a 16 días de edad. Los hemisferios cerebrales fueron extraídos del cráneo, eliminadas las meninges, disociados por el paso a través de una aguja de 2 mm de calibre, y a continuación tamizados (tamaño del poro 82 m m).

Para realizar el cultivo fue empleado el medio Eagle con modificación Dulbecco (DMEM) y suplementado con un 20% de suero fetal de carnero (Serva) y antibióticos (penicilina y estreptomicina: 1 ml/l, Sigma Chemical, Co.). Las células se colocaron en placas Petri de 35 mm de diámetro con polilisina 0,10 mg/ml (Sigma Chemical, Co).

Pasadas 12 horas, el medio era cambiado con medio nutritivo sin suero y formado por DMEM, insulina (400 m l/l), transferrina (50 mg/l), progesterona (100 m l/l), putrescina (16 mg/l), selenito sódico (100 m l/l) y penicilina/estreptomicina (1 ml/l). (FOTOGRAFIA Nº 1).

Después de 3 días de cultivo se añadió beta-aminopropionitrilo en las siguientes concentraciones 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M y 10-3 M y etilenglicol en concentraciones entre 10-8 y 10-4 M para conocer los cambios morfológicos y los efectos producidos en las células acetilcolinesterasa positivas AChE+. Pasadas 24 horas de incubación con beta-aminopropionitrilo por un lado y con etilen glicol por otro, los cultivos fueron teñidos con azul de metileno al 1% y procesados para su estudio morfológico. El estudio de viabilidad celular se realizó después de teñir las células con el colorante azul al 5%.

La actividad acetilcolinesterasa fue determinada después de 24 horas de exposición a etilenglicol según el método de Karnovsky y Roots.

Pasadas 36 horas de cultivo se añadió metilmercurio en concentraciones comprendidas entre 10-3 y 10-7 M para conocer los cambios morfológicos producidos.

 

RESULTADOS

Las interacciones observadas en los cultivos en presencia de etilenglicol consistían en degeneración neuronal sin afectar el cuerpo celular, variando la talla neuronal, disminuyendo el número de células AChE+, presencia de células gliales y agrupamientos celulares reactivos.

En presencia de concentraciones de etilenglicol comprendidas entre 10-4 y 10-8 M disminuía el número total de neuronas y de células AChE+. (FOTOGRAFIA Nº 2).

La administración de metilmercurio produjo degeneración celular y muerte, degeneración axonal y de fibras nerviosas, disminución de sinapsis e inhibición del desarrollo celular y de la reproducción celular, disminución de la conexión nerviosa y reagrupamientos y destrucción celular. (FOTOGRAFIA Nº 3).

Las observaciones realizadas tras la administración de beta-aminopropionitrilo consistían en daño celular irreversible con destrucción de la población neuronal. Las neuronas perdían sus prolongaciones y se agrupaban sus cuerpos, se producía disminución de sinapsis debido a la degeneración neuronal lo que conduce a un daño permanente en el tejido nervioso. (FOTOGRAFIA Nº 4).

Por tanto, a concentraciones de 10-4 M, tanto el metilmercurio como el etilenglicol producían destrucción masiva de células; a dosis de 10-5 M, el efecto era manifiesto sobre células AChE+ con el metilmercurio y el etilenglicol, menor con el beta-aminopropionitrilo, y a dosis de 10-6 M, los efectos disminuyeron, pero persiste la acción de los tres tóxicos sobre las neuronas AChE+.

 

ICONOGRAFIA

Figura - 1
Figura - 1

Cultivo neuronal. Control

 

Figura - 2
Figura - 2

Efectos del metilmercurio sobre cultivos celulares nerviosos (neuronas).

 

Figura - 3
Figura - 3

Efectos del etilenglicol sobre neuronas.

 

Figura - 4
Figura - 4

Efectos del betaaminopropionitrilo sobre cultivos neuronales.

 

 

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Podemos concluir que los tres tóxicos actúan selectivamente sobre las células neuronales AChE+ provocando una persistencia de acetilcolina que explicaría la patogenia de dichos tóxicos y con una escala de mayor a menor toxicidad señalaríamos, metilmercurio, etilenglicol y beta-aminopropionitrilo

 

BIBLIOGRAFIA

C. Gensburger, M.A. Capó, J.C. Deloulme, M. Sensenbrenner. (1992).- Influence of Basic Fibroblast Growth Factor on the Development of Cholinoceptive Neurons from Fetal Rat Cerebrum in Culture. Dev. Neurosci. 14:278-281.

M.A. Capó, C.E. Alonso, M.B. Sevil, M.T. Frejo. (1994).- "In Vitro" Effects on MetHyl-Mercury on the Nervous System: A Neurotoxicologic Study. JEPTO, 13(2):117-123.

M.A. Capó, M.B. Sevil, M.E. López, M.T. Frejo. (1993).- Ethylene Glycol Action on Neurons and its Cholinimimetic Effects. JEPTO, 12(3):155-159.

M.A. Capó, M.B. Sevil, M.T. Frejo, M.J. Anadón-Baselga, C.E. Alonso. (1994).- In Vitro Neuronal Changes Induced by B-Aminopropionitrile. JEPTO, 13(4):259-264.

M.A. Capó y M. Palencia. (1998).- Sistemática en la Preparación de Cultivos en Células Nerviosas. Animales de Experimentación, La Revista Hispanoamericana Vol.3 No.4.Verano 1998: 18-23.

C. Ressler, P. Restore, RH. Erenberg. (1961).- Isolation and identification of a neuroactive factor from Lathyrus latifolius. Science, 134:188-190.

M.J. Karnovsky, D. Roots. (1964).- A "directcoloring" thiocholine method for cholinest-erases. J. Histochen Cytochen, 12:219-221

 

 


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