ESCLEROSIS MULTIPLE:
APROXIMACION EPIDEMIOLOGICO-GENETICA EN HABITANTES DE ANTIOQUIA-COLOMBIA

Desequilibrio de Ligamiento al HLA DQa

JL Sánchez^1,2, LG Palacio¹, AC Londoño¹, CS Uribe²,ME Jiménez¹, LA Villa¹, JM Anaya⁴, ML Bravo³, N Jaramillo³,
G Bedoya³, C Espinal³, I Jiménez¹ and M. Arcos-Burgos^1,3.

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**Palabras claves: Genética de Esclerosis Múltiple - Enfermedades Desmielinizantes - Desequilibrio de Ligamiento - HLA DQa.

Resumen

La discriminación y cuantificación de los componentes ambientales y genéticos en el desarrollo de EM no ha podido ser hecha. Con la finalidad de acercarnos a la discriminación de dichos componentes, nosotros hemos pesquisado casos afectados de EM a partir de la Comunidad Paisa de Antioquia, Colombia, situada en el trópico, para detectar posible desequilibrio de ligamiento al HLA, locus DQa, aspecto que revelaría la importancia del componente genético en el desarrollo de MS. Un análisis de contingencia entre las distribuciones genotípicas del HLA DQa de los casos y controles, usando remuestreo de Monte Carlo para solucionar el problema del tamaño muestral que es inherente a las poblaciones con baja prevalencia de EM, reveló que existen diferencias significativas entre las dos distribuciones. La tendencia alélica observada fue de un incremento de los alelos 1.1, 1.2 y una disminución de los alelos 3 (con un p significativamente < de 0.05) y 4 en la población afectada. Los mismos resultados han sido descritos en otras poblaciones de origen caucasoide no localizadas en el trópico, lo que puede indicar que este componente genético descrito en la población caucasoide se ha mantenido en la población de afectados de EM originarios de Antioquia y que continúa siendo importante para el desarrollo de la enfermedad.

Abstract

Discrimination and quantification of the environmental and genetic components involved in developing Multiple Sclerosis (MS) have not been made. In order to discriminate these components we have ascertained affected individuals by MS belonging to the Paisa community from Antioquia-Colombia, a state localized in the tropical area of South America, to detect eventual linkage disequilibrium to HLA, locus DQa, which could demonstrate the relevance of the genetic component. A contingence analysis among case-control HLA DQa genotype distributions, by using Monte Carlo resampling method to solve small number sample, showed that there are significant differences between the two groups. We observe that HLA DQa 1.1, 1.2 allele frequencies were higher in the cases than in the controls. Also, there was significant HLA DQa 3 allele lower frequency (p<0.05) in the cases than in the controls. Similar results have been described in other Caucasian populations living in non tropical areas. Before results could indicate that the Caucasoid populations genetic component implied in the susceptibility to MS have remained in Paisa community, whether the environmental component, being meaningful to develop MS.

Introducción

La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad crónica, autoinmune, con un alto componente genético, caracterizada por lesiones desmielinizantes múltiples dispersas en el sistema nervioso con predilección por los nervios ópticos, el tallo cerebral, la médula espinal y la sustancia blanca periventricular (1). La EM es rara en el trópico con un definitivo patrón latitudinal, mucho más prevalente en el Hemisferio Norte a partir del Trópico de Cáncer y en el Hemisferio Sur por debajo del Trópico de Capricornio. En América se reporta una prevalencia de 35.5/100.000 por debajo del paralelo 37 y 68.8/100.000 por encima del paralelo 37 (2). Similarmente, se ha encontrado un gradiente norte - sur en el oeste de Europa y también hay un gradiente similar con incremento de la latitud en el Hemisferio Sur, particularmente en Australia y Nueva Zelanda (3). Tales gradientes no han sido demostrados en países asiáticos o africanos localizados en las mismas latitudes pero con prevalencias de EM mucho mas bajas y homogéneas.

Cuando el componente étnico es tomado en cuenta, algunos estudios han mostrado diferentes prevalencias de EM en poblaciones provenientes de diversas razas. Por ejemplo, la EM es particularmente común en individuos con ancestros del norte de Europa (Reino Unido, Islandia, Irlanda), pero la prevalencia es mucho mas baja en individuos de otros grupos étnicos tales como los mongoloides (incluyendo amerindios) y negroides (4,5).

Varios estudios han demostrado un fuerte desequilibrio de ligamiento al DR2, DW2 y DQ del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) al que aparece muy fuertemente ligado el fenotipo de afección por MS (6). Reportes tempranos de una asociación del HLA-A3 y HLA-B7 con la EM se basaron probablemente en el ligamiento de DW2 o DR2 con HLA-A3 y HLA-B7(7). Se ha demostrado en varios estudios realizados en poblaciones caucasoides que la frecuencia de HLA-A3, HLA-B7 y HLA-DW2 es significativamente mas alta en individuos afectados de EM que en individuos controles no afectados (8). En los últimos años, tres grupos diferentes desarrollaron mapéo completo del genoma humano, analizando grupos diferentes de familias con algún miembro afectado de EM (6,9,10). Todos ellos reportaron ligamiento al HLA. Sin embargo, el modelo genético que explique el modo de transmisión de la susceptibilidad para desarrollar EM es aun incierto. Aparentemente el modelo multifactorial más efectos epistáticos es el más probable. Otros loci de susceptibilidad fueron mapeados sobre los cromosomas 2,3,5,11,17 and X. En otro estudio genético desarrollado sobre 21 familias extendidas con afectados de EM, originarios de zonas de alto riesgo del oeste de Finlandia, se localizó un locus de susceptibilidad en la región 5p14-p12, una región sinténica con el locus murino Eae2, que predispone a desarrollar Encefalomielitis Alérgica Experimental (EAE), una forma de enfermedad desmielinizante parecida a la EM (11).

Los estudios de EM realizados en el trópico son escasos, probablemente debido a su baja prevalencia en estas regiones. Además, encontrar una población homogénea en el trópico, con un alto contenido racial caucásico y con una alta susceptibilidad de desarrollar EM, es también difícil. La población de Colombia es una mezcla de caucasoides (en su mayoría españoles), africanos (negroides) y amerindios (mongoloides) (12). Los estudios antropológicos e históricos describen a los habitantes del departamento de Antioquia, "Comunidad Paisa", como la población mas claramente definida en Colombia. De acuerdo con los historiadores esta comunidad se origina en la colonización de Antioquia y El Viejo Caldas por Españoles, Judíos (Sefardíes o Marranos) y Vascos. De otro lado, la mezcla con poblaciones negroides y amerindios es baja (12,13,14,15). Los aspectos etno-geograficos anteriormente establecidos hacen que esta comunidad sea coyuntural para discriminar el componente racial y latitudinal en la susceptibilidad a desarrollar EM.

Este estudio caso-control pretende definir si existen diferencias en la distribución de las frecuencias genéticas del locus HLA DQµ entre los casos afectados de EM y los individuos sanos pertenecientes a la comunidad Paisa con el objetivo de atribuir esta diferencia a un desequilibrio de ligamiento que puede ser una evidencia a favor de la importancia de los aspectos genéticos en la susceptibilidad para desarrollar EM.

Materiales y Métodos

Muestra

Los individuos con diagnóstico presuntivo de EM fueron seleccionados de acuerdo con una estrategia de muestreo secuencial. Los lugares de pesquisa fueron el Instituto Neurológico de Antioquia (INDEA) y una pequeña proporción fue seleccionada a partir de consultorios particulares de los neurólogos involucrados en la investigación. A partir de la identificación del caso presuntivo, éste fue remitido para ser evaluado en un comité de diagnóstico creado ad hoc conformado por seis neurólogos, un reumatólogo, un epidemiólogo y un geneticista. En éste comité se definió las pruebas paraclínicas necesarias para determinar el caso o para descartarlo. Los controles fueron 900 individuos pertenecientes a la comunidad Paisa, que fueron estudiados en el Laboratorio de Genética y Ciencias Forenses de la Universidad de Antioquia. Estos individuos fueron parte de un estudio piloto para evaluar la estructura genética de la comunidad Paisa. Ellos son individuos no relacionados y los resultados de la distribución de las frecuencias genéticas han sido reportados previamente en Bravo et al.(15).

Diagnóstico.

El diagnostico se hizo con base en la presencia de síntomas y evidencia objetiva de lesión diseminada temporal y espacialmente en la sustancia blanca del sistema nervioso. El diagnostico definitivo de EM fue hecho por un STAFF conformado por el grupo de neurólogos involucrados en la investigacion. Se usaron los criterios de Poser (16).

Criterios de inclusión: El examen neurológico debe revelar anormalidades objetivas que puedan ser atribuidas a disfunción del SNC. Estas anormalidades pueden estar presentes al momento de la evaluación o estar documentadas en la historia clínica. La evidencia de enfermedad del SNC tiene que reflejar compromiso predominantemente de la sustancia blanca. Esto usualmente incluye signos y síntomas que reflejen disfunción de la vía piramidal, vía cerebelar eferente o aferente, fascículo longitudinal medio, nervios ópticos y columna posterior. El examen neurológico o la historia clínica debe suministrar evidencia de compromiso de al menos dos partes del SNC. La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y los Potenciales Evocados se usan para documentar una segunda lesión cuando únicamente se ha encontrado una anormalidad en el examen neurológico. La RMN confirmatoria tiene que presentar al menos 4 lesiones desmielinizantes que involucren la sustancia blanca o tres lesiones si una de ellas es periventricular y deben ser de un tamaño superior a 3 mm. de diámetro. La RMN solo se usa como criterio en pacientes menores de 40 años de edad en quienes no se encontró una explicación alternativa para la anormalidad. Los potenciales evocados se usan para documentar una segunda lesión cuando previamente se documente una anormalidad en un área del SNC diferente a aquella involucrada en la anormalidad presentada durante el examen clínico. Ellos deben practicarse en un laboratorio donde existan valores normales definidos para la población (el Laboratorio del Electromiografía del Instituto ha normalizado sus análisis en la población de Antioquia). Los patrones clínicos tienen que presentar al menos una de las siguientes características: Dos o mas episodios separados de empeoramiento, involucrando diferentes sitios del SNC, cada uno de ellos con una duración mínima de 24 horas y separados entre si por lo menos un mes, o lenta progresión de uno o más signos o uno o más síntomas durante al menos 6 meses. La edad de inicio de los signos y síntomas debe ser entre 10 y 60 años. La condición neurológica no puede ser explicada mejor por otra enfermedad. Nosotros realizamos los siguientes pruebas con el objetivo de descartar otras enfermedades que pudieran explicar los signos y síntomas presentes en los individuos incluidos en el estudio.: RMN de cráneo y medula, Hemograma completo, niveles séricos de vitamina B12 y ácido Fólico, VSG, proteína c reactiva, factor reumatoideo, ANAs, y VDRL.

Se excluyeron aquellos casos que no residieran en el departamento de Antioquia, en busca de una homogeneidad poblacional y teniendo en cuenta que la estructura genética mejor conocida es la del Departamento de Antioquia. Igualmente, se excluyeron pacientes con diagnóstico de enfermedades autoinmunes reumatológicas y metabólicas. Los pacientes con diagnóstico de enfermedad autoinmune reumatológica cumplieron criterios internacionales. Los niveles de vitamina B12 fueron medidos mediante radioinmunoanálisis y los valores entre 223-1132 UI.

Análisis Molecular

De todos los casos y controles se tomaron 30 ml de sangre a partir de la cual se extrajo el DNA usando el método DTAB, CTAB. La genotipificación de DQa se llevo a cabo utilizando el producto comercial de Perkin Elmer (AmpliType). En resumen, la secuencia completa de los alelos HLA DQµ del DNA es conocida. El producto comercial incluye los iniciadores (en inglés primers) para la PCR, los cuales amplifican entre 239 y 242 pares de bases del locus polimórfico HLADQµ. La tipificación es realizada mediante la hibridación del DNA amplificado y la detección visual se realiza por una tinción que se oxida enzimáticamente y que revela que sondas son complementarias para una muestra de DNA amplificada. Existen 6 alelos del HLA DQµ que pueden ser detectados: 1.1, 1.2, 1.3, 2, 3 y 4. Estos alelos determinan 21 genotipos posibles.

Análisis genético-estadístico

Los análisis de asociación fueron llevados a cabo sobre dos niveles de los datos. Primero se comparó mediante análisis de contingencia la distribución genotípica de los dos grupos usando una modificación del test no paramétrico de c2. Esta aproximación permite corregir los resultados inflados de c2 cuando las frecuencias esperadas son menores de 5. Esto por supuesto es un problema en nuestra base de datos puesto que el material esta restringido por la baja prevalencia y el número de individuos en las diferentes clases genotípicas es reducido. El método se denomina de agrupamiento (del inglés clumping) y ha sido desarrollado por Sham y Curtis17. Este usa el método de aleatorización y remuestreo de Monte Carlo mediante la simulación repetida para generar tablas con los mismos totales marginales como la tabla problema y contando el número de veces que un valor de c2 asociado a la tabla real se logra por los datos simulados aleatoriamente. De esta manera los niveles de significancia asignados son no sesgados con una seguridad que es dependiente del número de simulaciones realizada y que no depende de las correcciones de continuidad o valores esperados pequeños. Estos análisis fueron llevados a cabo usando el programa computacional CLUMP. El programa entrega 4 valores de c2, t1, t2, t3, t4. t1 representa el valor de c2 obtenido por el método convencional sobre la tabla original; t2 el valor de c2 obtenido mediante el uso de la tabla original con las casillas que contienen valores pequeños agrupadas; t3, un valor de c2 a partir de una tabla de 2x2 que se obtiene por la comparación de una columna de la tabla original contra el total de todas las otras columnas y t4, un valor de c2 obtenido mediante el agrupamiento de las columnas de la tabla original para maximizar el valor de c2. El aspecto novedoso de CLUMP es el nuevo valor de c2 que deriva, cuya racionalidad es su maximización. Esto semeja la prueba de una hipótesis post-hoc: colocar todas las columnas con el primer valor mas grande que el esperado en un grupo y todas aquellas con el segundo valor mas alto en otro grupo y luego determinar la diferencia entre los grupos. Este procedimiento produce un valor de c2 el cual no se distribuye como el estadístico c2 con un grado de libertad, pero esto no causa ningún problema en la interpretación porque la significancia del valor es determinada utilizando el método de Monte Carlo, mas que haciendo algún supuesto acerca de la distribución de la prueba estadística. Por ejemplo: Si el valor real de c2 fue alcanzado más de 15 o 20 veces. Los resultados deberían ser claramente no significativos. Es importante mencionar que los mejores resultados están dados por t1 y t4.

En segunda instancia, usamos una prueba di diferencia de proporciones de z con una cola, penalizando el valor de p obtenido por el número de repeticiones que usó la prueba (en nuestro caso 6 veces).

Esta investigacion cumplió con los requerimientos de la Resolución No 8430 de 1993 del Ministerio de Salud de la República de Colombia y de acuerdo con esta representa un riesgo mínimo para los individuos que mediante consentimiento informado aceptaron su participación. El presente estudio fue aprobado por el comité de ética del Instituto Neurológico de Antioquía.

Resultados

En el Apéndice I, se presenta cada uno de los casos con sus variables clínicas, demográficas y su genotipo a nivel de HLA DQa.

La Tabla 1. Presenta las distribuciones genotípicas en los casos y controles en los 21 genotipos posibles. Los análisis de contingencia usando el método de agrupamiento fueron los siguientes c2 (t1)=23.164(se alcanzó 0 veces después de 100 simulaciones), c2 (t2)=12.221(se alcanzó 0 veces después de 100 simulaciones), c2 (t3)=11.808(se alcanzó 0 veces después de 100 simulaciones) y c2 (t4)=21.900(se alcanzó 0 veces después de 100 simulaciones). Estos resultados significan que existe una clara diferencia en las distribuciones genotípicas de los dos grupos.

Tabla 1. Distribuciones genotipicas de HLA DQa en casos y controles

Estas diferencias y la direccionalidad de ellas pueden ser mejor apreciadas en la Tabla 2, donde se presentan las frecuencias genéticas de los diferentes alelos para los dos grupos, casos y controles, estimadas de acuerdo con el método de máxima verosimilitud. Como puede observarse al realizar la prueba de proporciones de z de una cola solo encontramos diferencias significativas para el alelo 3, que se observa en una frecuencia menor en los individuos afectados de EM. No obstante, se observan diferencias en la proporción de los alelos 1.1, 1.2 que se encuentran en mayor frecuencia en los individuos afectados, y en el alelo 4 que se encuentra en mayor frecuencia en la población normal.

Tabla 2. Frecuencia genetica de los alelos HLA DQa en casos de EM y en controles no afectados, en el departamento de Antioquia

Discusión

Existe una clara dificultad en la discriminación de los componentes genético y ambiental y su papel en el desarrollo de EM. Muchos estudios en poblaciones caucasoides han mostrado un fuerte componente genético involucrado en la agregación familiar que se observa en familias pesquisadas a partir de probandos con MS. No obstante el modelo genético que subyace a esa agregación es todavía un misterio (6,9,10). Existen otros estudios en los que se demuestra la importancia del componente ambiental en la génesis del fenotipo EM. Estos últimos estudios han mantenido constante el componente genético (v.g. una población racialmente homogénea) (3). Los estudios en búsqueda de genes mayores han entrado en la fase de tamizaje total del genoma, pero los resultados a través de las poblaciones son variables y la mayor consistencia se tiene con relación al HLA.

Este estudio pretendió encontrar desequilibrio de ligamiento a un locus marcador localizado en el cromosoma 6p y que hace parte del HLA. en una población racialmente homogénea, localizada en el trópico, con la finalidad de evaluar los dos componentes, ambiental y genético. Nosotros realizamos una prueba de contingencia que usa los métodos de remuestreo de Monte Carlo, con la finalidad de solucionar el número bajo de datos, un problema inherente a todas las poblaciones tropicales donde la prevalencia de EM es baja. De nuestro análisis se puede concluir que existen diferencias significativas en las distribuciones genotípicas entre la población de afectados de EM y la población general. Hay una frecuencia del alelo 3 que es menor significativamente en los individuos afectados. Esto se compensa con una disminución de los alelos 1.1, y 1.2 en los individuos normales. Estos mismos resultados, con relación a los mismos alelos, han sido descrito en varias series internacionales de origen caucasoide (7,8). Estos resultados pueden ser explicados en términos de que existe un componente genético mayor ligado al HLA o estar el mismo sistema de histocompatibilidad implicado en el desarrollo de EM. La importancia de nuestros resultados tiene que ver con que los mismos componentes genéticos descritos para poblaciones caucasoides no tropicales se repiten en una población caucasoide tropical, aspecto que revela la importancia del componente genético como disparador del fenotipo MS.

Es necesario usar un número mayor de marcadores sobre la región del HLA como los STR's para definir claramente este desequilibrio e incrementar el número de cromosomas analizados con la finalidad de disminuir la probabilidad de sesgo de muestreo tanto de marcadores como de unidad de análisis (cromosomas).

 

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