MODELOS EXPERIMENTALES DE ENFERMEDAD DE PARKINSON

Mª Rosario Luquin

Unidad de Neurología Experimental. Departamento de Neurología.
Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona. España

La pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) de la sustancia negra compacta (SNc) junto a una disminución del contenido de dopamina estriatal, representan las alteraciones histológicas y neuroquímicas más importantes de la enfermedad de Parkinson (EP) y son responsables de la mayoría de las alteraciones motoras que presentan los pacientes parkinsonianos. Por ello, el desarrollo de modelos animales de EP se ha orientado a inducir moficaciones estructurales o funcionales de la transmisión dopaminérgica nigroestriada. Lógicamante, como modelos que son, ninguno de ellos es superponible a lo que representa la EP desde el punto de vista motor, histológico o neuroquímico, pero son de gran utilidad para el estudio del funcionamiento de los ganglios basales, la actividad antiparkinsoniana de determinadas sustancias, el estudio de los mecanismos implicados en la muerte de las neuronas dopaminérgicas y la eficacia de posibles tratamientos neuroprotectores.

Parkinsonismo inducido por neurotoxinas

6-hidroxidopamina (6-OHDA)

La 6-OHDA es la neurotoxina más ampliamante utilizada en el desarrollo de modelos experimentales de EP en roedores. Cuando es administrada por vía sistémica destruye las neuronas adrenérgicas de los ganglios simpáticos pero carece de acción tóxica a nivel del sistema nervioso central. Sin embargo, la inyección intracerebral de 6-OHDA produce una destrucción selectiva de neuronas catecolaminérgicas. Esta especificidad es debida a su alta afinidad por el sistema de transporte de catecolaminas. Ungersted en 1968 describió por primera vez que la inyección estereotáxica de 6-OHDA en el haz nigroestriado inducía una lesión selectiva de las neuronas DA de SN.

Aunque existen estudios que demuestran que la 6-OHDA posee una potente acción inhbidora de la cadena respiratoria mitocondrial, la muerte neuronal DA inducida por 6-OHDA está ligada fundamentalmente a la formación de H₂O₂, radicales libres tipo hidroxilo (OH^.) y quinonas que se producen en su metabolización. Así, sustancias antioxidantes como vitamina E ó N-acetil-cisteína, inhibidores de la MAO y quelantes de hierro como desferoxamina protegen a las neuronas DA de la acción neurotóxica de la 6-OHDA.

La inyección de 6-OHDA en el haz nigroestriado, induce una degeneración neuronal que afecta por igual a las neuronas DA de la sustancia negra pars compacta (A₉) que proyectan al estriado y a las del área tegmental ventral (A₁₀) que forman parte del sistema dopaminérgico mesolímbico. Produce además alteraciones neuroquímicas en el estriado que se caracterizan por un descenso muy importante de los niveles de DA, serotonina, encefalina y sustancia P, mientras que los niveles estriatales de neurotensina aumentan. Desde el punto de vista histológico, en general la lesión de SN inducida por 6-OHDA es más extensa que la que se objetiva en los pacientes parkinsoniamos en los que las neuronas del ATV están parcialmente respetadas. Por ello, algunos autores han propuesto utilizar como modelo de EP la inyección de 6-OHDA directamente en la SN pars compacta evitando de esta manera la afectación de las neuronas DA del área A₁₀.

Desde el punto de vista conductual, los animales con lesión unilateral de la SN, inducida por inyección directa en el haz nigroestriado o en la SN, presentan inmediatamente después de la cirugía y de forma espontánea una conducta rotatoria ipsilateral a la lesión que se mantiene durante las 24 horas siguientes. Esta conducta rotatoria es debida al desequilibrio que existe entre el contenido de dopamina en el estriado homolateral y contralateral a la lesión dopaminérgica, de tal forma que el animal tiende a rotar siempre hacia el lado contralateral al estriado dominante.

La lesión unilateral de la SN induce cambios neuroquímicos y electrofiológicos en el sistema nigroestriado que intentan compensar el déficit de dopamina inducido por la pérdida de neuronas dopaminérgicas. Por ejemplo, se ha descrito una inducción y activación de tirosina hidroxilasa (enzima limitante de la síntesis de catecolaminas) en las neuronas dopaminérgicas todavía funcionantes, aumento de la cantidad de dopamina liberada en el estriado por las terminales dopaminérgicas existentes y un incremento en el número de receptores dopaminérgicos estriatales postsinápticos (up regulation). Este incremento aparece únicamente cuando la pérdida de neuronas dopaminérgicas es superior al 90% y tiene lugar al cabo de 4 semanas de haberse producido la denervación dopaminérgica. En general, la mayoría de los trabajos publicados demuestran que el fenómeno de hipersensibilidad por denervación o "up regulation" afecta preferentemente a los receptores dopaminérgicos estriatales D₂, mientras que el número de receptores D₁ incrementa levemente o no se modifica. Sin embargo, aunque algunos cambios neuroquímicos son ya evidentes con lesiones dopaminérgicas parciales la actividad de las neuronas dopaminérgicas de la SN únicamente incrementa cuando la depleción de DA estriatal es superior al 96%. En estos casos la frecuencia de descarga de las neuronas DA de la SN se incrementa, pero no es suficiente para compensar el déficit de DA.

Los animales con lesión unilateral de la vía nigroestriada, presentan una rotación ipsilateral a la lesión cuando se les administran sustancias que aumentan la liberación de dopamina como anfetamina, y muestran una rotación contralateral al lado de la lesión cuando reciben agonistas dopaminérgicos como apomorfina. La rotación contralateral inducida por apomorfina u otros agonistas dopaminérgicos, es debida al incremento del número de receptores dopaminérgicos que existe en el estriado homolateral a la lesión como consecuencia de la denervación. Por el contrario, la anfetamina al incrementar la liberación de dopamina en las terminales presinápticas incrementa la concentración de DA únicamente en estriado contralateral a la lesión, produciéndose un desequilibrio funcional a favor del estriado contralateral.

La administración de 6-OHDA en la SN o en el haz nigroestriado induce una degeneración estática, rápida y casi completa de las neuronas DA de la SN. Esta degeneración difiere sustancialmente de la que ocurre en la EP en la que hipotéticamente la pérdida neuronal es lenta y progresiva. Por ello, en los últimos años está siendo utilizando como modelo de degeneración neuronal DA la inducida por inyección estriatal de 6-OHDA. La inyección estriatal única de 6-OHDA (20 mg) o en infusión continua produce una atrofia y degeneración lenta y progresiva de las neuronas DA de la sustancia negra homolateral. En este caso, la degeneración neuronal no parece ser debida a un transporte axonal retrógrado de la neurotoxina desde el estriado hacia las neuronas DA nigrales, sino que corresponde a una degeneración neuronal retrógrada secundaria a la lesión de terminales DA nigroestriadas. Este modelo resulta muy interesante por varias razones. En primer lugar representaría un modelo de EP en un estadio inicial de la enfermedad ya que la pérdida neuronal que se obtiene oscila entre un 60-70%. Por otro lado, permite de acuerdo a la dosis de 6-OHDA inyectada en el estriado, obtener una lesión parcial nigroestriada y por tanto puede ser el modelo ideal a utilizar para el estudio del efecto neuroprotector de determinadas sustancias. Por último, el hecho de que la inyección estrital de 6-OHDA induzca una degeneración progresiva de las neuronas DA de la SN apunta la posibilidad de que en la EP la degeneración primaria ocurra a nivel de las terminales dopaminérgicas estriatales y secundariamente exista una degeneración retrógrada de las neuronas DA de la SN. Esta hipótesis es apoyada por el hecho de que neurotoxinas dopaminérgicas como 6-OHDA y MPTP cuando se administran por vía sistémica o intraventricular resultan más tóxicas sobre las terminales DA que sobre el soma neuronal.

Parkinsonismo inducido por MPTP

La 1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidropiridina (MPTP) es un derivado meperidínico. Su capacidad de inducir un síndrome parkinsoniano fue descubierta de forma accidental en un grupo de heroinómanos que de forma accidental se inyectaron esta sustancia. Estos sujetos mostraban un síndrome parkinsoniano indistinguible desde el punto de vista semiológico de la EP y toda su sintomatología revertía con l-dopa o agonistas dopaminérgicos. Posteriormente se comprobó que su administración a animales de laboratorio y fundamentalmente a primates, producía un síndrome parkinsoniano asociado a una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la SNc.

Especies animales

La neurotoxicidad del MPTP ha sido demostrada en diversas especies animales incluyendo macacos, ratones negros (C57) y gatos. No existe una explicación adecuada para la diferente vulnerabilidad de las distintas especies animales al MPTP. Se ha postulado que pueden estar relacionadas con diferencias en el metabolismo del MPTP y en la distribución y retención cerebral de su metabolito MPP⁺. Para algunos autores la neurotoxicidad del MPTP es dependiente del contenido en neuromelanina ya que la afinidad del MPP⁺ por la neuromelanina es muy alta y este pigmento está presente en las neuronas DA, mientras que para otros está relacionada con la actividad MOA-B a nivel de los capilares cerebrales.

Aunque especies animales como la rata, son resistentes a la administración sistémica de MPTP, su metabolito MPP⁺ es una toxina potente y produce destrucción de las neuronas DA de la SN cuando se administra en estriado. Por tanto, es posible que la diferente vulnerabilidad que presentan las especies animales al MPTP sea dependiente de factores relacionados con la distribución y metabolización cerebral del MPTP.

Alteraciones conductuales

La exposición de humanos al MPTP da lugar a un síndrome parkinsoniano crónico caracterizado por temblor, acinesia, rigidez, postura en flexión, alteración de reflejos posturales y tendencia al mutismo, que revierte con la administración de l-dopa o agonistas DA. Una gran variedad de primates no humanos desarrollan también un síndrome parkinsoniano cuando se les administra MPTP. Estos animales muestran una reducción muy importante de la actividad espontánea, rigidez, bradicinesia y temblor de actitud. Muy pocos desarrollan el temblor de reposo característico de la EP. Los síntomas parkinsonianos son inicialmente transitorios, pero se hacen permanentes con la administración repetida de la toxina. Los mecanismos implicados en la recuperación espontánea que experimentan estos animales no se conocen, pero pueden estar relacionados con una alteración transitoria de otros sistemas de neurotransmisión, diferentes al nigroestriado.

Características histológicas

Hasta el momento únicamente se dispone del estudio necrópsico de uno de los individuos que desarrollaron un síndrome parkinsoniano tras inyectarse una drogra de diseño que contenía MPTP. El estudio histológico mostró una lesión selectiva de las células DA de la SNc. Sin embargo, los estudios realizados en primates han demostrado que la lesión inducida por MPTP no afecta de forma exclusiva a esta población neuronal. Diversos autores han demostrado que en macacos añosos la administración de MPTP induce además una degeneración de las neuronas DA del ATV y del locus coeruleus, donde se han descrito cuerpos de inclusión eosinofílicos que se asemejan a los cuerpos de Lewy que existen en los cerebros de los pacientes con EP. La degeneración del ATV aunque en menor grado, es evidente también en los primates jóvenes. Sin embargo, la pérdida neuronal es siempre de mayor intensidad en las neuronas DA de la SNc.

Alteraciones neuroquímicas

Desde un punto de vista neuroquímico existe una gran similitud entre el parkinsonismo inducido por MPTP y la EP. La acción neurotóxica del MPTP produce una gran variedad de cambios neuroquímicos, que a nivel de la transmisión DA se caracteriza por una reducción de la concentración de DA y de sus metabolitos ácido 3,4-dihidroxifenilacético y ácido homovanílico, disminución de la actividad del enzima tirosina hidroxilasa y alteración en la densidad de receptores DA. Al contrario de lo que sucede en la EP donde la depleción de DA es más intensa en el putamen que en núcleo caudado, los primates expuestos de forma crónica a la acción del MPTP muestran una disminución homogénea y no selectiva del contenido de DA estriatal, siendo de igual intensidad en ambas estructuras estriatales. Otras áreas cerebrales con inervación DA como el núcleo accumbens, hipocampo, amígdala y cortex cerebral también son afectadas por MPTP y la reducción en el contenido de DA es similar a la descrita en estriado. Por el contrario, los niveles de DA no se alteran en estructuras como el globo pálido lateral y medial que recibe proyecciones directas de la SN

Las concentraciones de noradrenalina y serotonina en estriado no se modifican con la administración aguda de MPTP. Sin embargo, se reducen de forma significativa en estriado y corteza en los animales tratados de forma crónica con esta neurotoxina. No existe evidencia de que el MPTP induzca alteraciones en los sitemas colinérgico, GABAérgico o glutamatérgico en primates. Sin embargo, los niveles de diferentes neuropéptidos, sustancia P, dinorfina y encefalina en el estriado, sustancia negra y pálido están reducidos en animales tratados crónicamante con MPTP. Estas mismas alteraciones han sido descritas en pacientes con EP. Sin embargo, no se conoce si son consecuencia de la degeneración de neuronas que contienen estos pétidos o representan cambios adaptativos a denervación nigroestriada.

Tabla 1. Diferencias y similitudes entre la enfermedad de Parkinson y el parkinsonismo inducido por MPTP en primates

Mecanismo de toxicidad

El MPTP, tras su administración, desaparece rápidamente de los tejidos biológicos y es convertido en un derivado piridínico, 1-metil-4-fenil 2,3,dihidropiridínico MPDP⁺ y MPP⁺ por la acción del enzima monoamino oxidasa-B (MAO-B). Aunque ambas formas de MAO oxidan el MPTP in vitro, únicamente los inhibidores de la MAO-B como deprenil y pargilina son capaces de bloquear la toxicidad del MPTP in vivo. Por el contrario, inhibidores de la MAO-A como clorgilina resultan ineficaces. Esta aparente paradoja puede ser explicada por la diferente cinética de las dos formas de MAO ó probablemente por que los sitios de metabolización del MPTP por la MAO-B y MAO-A en el cerebro son diferentes.

Existe evidencia de que el primer paso metabólico de MPTP a MPDP⁺ no tiene lugar en las neuronas DA ya que estas tienen una actividad MAO-B muy baja. Originalmente se atribuyó a las neuronas serotonérgicas del rafe la transformación del MPTP por tener una actividad MAO-B muy elevada, sin embargo, es más probable que ésta tenga lugar en las células gliales que rodean a las neuronas DA.

Aunque existe la posibilidad de que la toxicidad inducida por MPTP se deba a su metabolito intermedio MPDP⁺, la mayoría de los trabajos publicados sugieren que la toxicidad está ligada al MPP⁺. Por ejemplo, tras la administración sistémica de MPTP, el MPP⁺ se acumula en el sistema DA nigroestriado, en cultivos de células DA y en hepatocitos aislados el MPP⁺ es una toxina muy potente, la inyección intraestriatal de MPP⁺ es tóxica sobre las neuronas DA de la SN y por último el MPP⁺ inhibe enzimas implicados en la síntesis de DA. En base a estos hallazgos, la mayoría de los trabajos se han centrado en el estudio de cómo el MPP⁺ ejerce su acción tóxica sobre las neuronas DA.

Estrés oxidativo

Una de las hipótesis propuestas para explicar la muerte neuronal inducida por MPTP sugiere que el daño celular se origina por la producción intraneuronal de radicales superóxido y otros radicales libres citotóxicos que se originan durante la oxidación intracelular del MPP⁺, en cantidades que exceden la capacidad celular para neutralizalos Esta hipótesis se realizó inicialmente en base a la homología que existe entre el MPP⁺ y el herbicida paraquat.

En homegeneizados de cerebro, el MPTP induce la producción de radicales hidroxilo, y acelera el acúmulo de lipofucsina en el cerebro, especialmente si el medio carece de vitama E. Por otro lado, el MPTP y MPP⁺ incrementan la autoxidación de la DA que a su vez genera radicales libres, y disminuyen los niveles intracelulares de glutation en roedores, efecto que es bloqueado por antioxidantes como vitamina E.

Sin embargo, si el daño DA inducido por MPTP fuera relacionado con una producción excesiva de radicales libres antioxidantes, los quelantes de radicales libres deberían proteger frente a la toxicidad del MPTP. Sin embargo, la administración de ácido ascórbico ó a-tocoferol no reducen el daño dopaminérgico inducido por MPTP y potentes quelantes de metales de transición no sólo no protegen frente al MPTP sino que exacerban su toxicidad.

Aunque la mayoría de los trabajos apuntan hacia la no participación de los radicales libres en la muerte celular inducida por MPTP, recientemente se ha demostrado en roedores y primates que inhibidores de la oxido nítrico sintasa (NOS) protegen de forma eficaz frente a la lesión DA inducida por el MPTP. La NOS es un enzima dependiente de calcio cuya activación se produce por estimulación de receptores NMDA. De su activación depende la síntesis de óxido nítrico el cual a su vez puede producir una inhibición directa de la cadena respiratoria mitocondrial o dar lugar a la formación de peroxinitritos, que son potentes inductores de estrés oxidativo.

Hipótesis mitocondrial

Una segunda hipótesis de toxicidad se ha centrado en los hallazgos de que el MPP⁺ es un potente inhibidor de la respiración celular ligada a NDAH. Nicklas et al fueron los primeros en describir in vitro que el MPP⁺ producía a altas concentraciones (1 mM), una inhibición completa de la oxidación de los sustratos piruvato/maleato y glutamato/maleato ligados a NAD⁺. In vivo donde se requieren concentraciones mucho mayores del tóxico (10 mM) para que tenga lugar la inhibición de la cadena transportadora de electrones, se ha comprobado que el MPP⁺ es transportado desde el citoplasma al interior de la mitocondria en contra de un gradiente dependiente de ATP.

Los efectos del MPP⁺ sobre las mitocondrias han sido bien caracterizados. A altas concentraciones bloquea la oxidación de la NADH, existiendo una perfecta correlación entre el acúmulo de MPP⁺ y la depleción de ATP. Por otro lado, la inhibición del transporte de electrones mitocondrial induciría una disminución en la producción de APT celular, que daría lugar a una alteración en la organización de los microfilamantos celulares. Finalmente, la depleción de ATP inducida por MPP⁺ provocaría una alteración de los potenciales transmembrana y una depleción de glutation reducido (GSH) extracelular, principal defensa de la célula frente al estrés oxidativo.

Aunque la inhibición del complejo I mitocondrial resulta suficiente para explicar la toxicidad celular, no puede excluirse la posibilidad de que el estrés oxidativo inducido por MPTP y/o MPP⁺ en el interior de la mitocondria pueda contribuir a la acción tóxica del MPTP. Por ejemplo, se ha demostrado que el MPP⁺ induce peroxidación lipídica en cultivos de células DA y ésta es bloqueada por inhibidores específicos de la peroxidación lipídica.

Alteración de la homeostasis del calcio

Estudios realizados en hepatocitos aislados, sugieren que el evento bioquímico específico que precede a la muerte celular es la depleccion de Ca⁺⁺ mitocondrial seguido de un incremento muy marcado en la concentración de Ca⁺⁺ citosólico, secundario a una alteración del transporte de Ca⁺⁺ a través de la membrana celular. El incremento de la concentración de Ca⁺⁺ intracelular puede ser el mecanismo de muerte común en diferentes condiciones como la isquemia o la neurodegeneración inducida por 6-OHDA y MPTP. La neuroprotección obtenida frente a MPP⁺ con antagonistas NMDA, ha sido interpretretada en base al bloqueo en la entrada de Ca⁺⁺ que producen estos agentes. Del mismo modo, antagonistas del Ca⁺⁺ como nimodipino también reducen el daño celular inducido por MPTP.

Otros modelos experimentales

Las nuevas técnicas de biología molecular han permitido obtener cepas de ratones en los que se ha eliminado la expresión de determinados genes. Para el estudio de la EP se dispone en la actualidad de ratones que carecen específicamente de un subtipo de receptor DA, lo cual ha ayudado a conocer su verdadera función en las respuestas motoras mediadas por DA, así como su posible acción moduladora en el funcionamiento de los ganglios basales. Por ejemplo, el análisis histológico de ratones que carecen de receptores DA D₁, no muestra diferencias anatómicas groseras en relación con los animales control. Sin embargo, la expresión de dinorfina está enormemente reducida en el estriado y estructuras relacionadas de los ganglios basales. Estos animales muestran de forma espontánea una marcada hiperactividad motora que no se modifica por la acción de agonistas o antagonistas D₁. Estos resultados sugieren que los receptores DA D₁ modulan por una parte, la arquitectura neuroquímica de los ganglios basales y su expresión resulta crítica para que exista una conducta motora normal. Resultados similares se han observado en ratones que carecen de receptores DA D₃. Estos animales muestran una marcada hiperactividad motora, lo que sugiere que los receptores D₃ ejercen una función inhibidora en la expresión de determinadas respuestas motoras mediadas por la DA. Por el contrario, ratones que no expresan receptores DA D₂ muestran una marcada rigidez, hipocinesia, alteraciones posturales y una actividad motora espontánea reducida, que se asemeja a la sintomatología descrita en los pacientes con EP. En base a estos hallazgos parece claro que la estimulación de receptores DA D₂ es responsable de la mejoría clínica de los pacientes con EP en tratamiento con l-dopa y cuestionan la utilidad de agonistas selectivos D₁ y D₃ en el tratamiento de estos pacientes.

Tabla 1. Diferencias y similitudes entre la enfermedad de Parkinson y el parkinsonismo inducido por MPTP en primates

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