(IN VITRO STUDY ON THE EFFECT OF ETHANOL ON BASAL AND STIMULATED PYROGLUTAMYL AMINOPEPTIDASE ACTIVITY IN MOUSE BRAIN)
COMMUNICATION
TOPIC:
MISCELANEOUS
Authors:
María Dolores Mayas, José Manuel Martínez-Martos, María Jesús Ramírez-Expósito, Isabel Prieto, Garbiñe Arechaga, Manuel RamírezÁrea de Fisiología, Facultad de Ciencias Experimentales y de la Salud, Universidad de Jaén. E-23071, Jaén, España. Correspondencia: jmmartos@ujaen.es
Introduction. Pyroglutamyl aminopeptidase (pGluAP) is an omega peptidase which removes pyroglutamyl N-terminals residues from peptides and arylamidase derivatives. This activity is thought to be involved in the regulation of several physiological mechanisms on the central nervous system. pGluAP can modulate various susceptible endogenous substrates susch as thyrotropin-releasing hormone (TRH). It is well known that TRH plays an important role in the modulation of the behavioral changes induced by ethanol and others drugs.
The aim of this work was to study the in vitro effects of ethanol (25, 50 and 100 mM) on the pGluAP activity and its ability for modulating the TRH.Material and Methods. pGluAP activity was measured in synaptosomes from cerebral cortex of mouse, using pyroglutamyl- -naphthylamide as substrate in basal and stimulated (K+ 25 mM) conditions, and in presence or absence of calcium on the buffer.
Results. In basal conditions, ethanol produced an inhibition of the pGluAP activiy in presence or absence of calcium, this inhibition is not dose-related. However, the stimulation with K+ 25 mM did not produce a modification of pGluAP activity in presence of calcium, but produce an inhibition in absence of it. Depolarization in presence or absence of calcium and ethanol produced an inhibition of pGluAP activity, which changed in function of ethanol concentration.
Conclusions. Ethanol modifies pGluAP activity in basal conditions by a mechanism independent of calcium, but the changes obtained from the stimulation with K+ may be a calcium-dependent mechanism. This variations of pGluAP activity induced by ethanol, and their effects on their endogenous substrates (specially TRH) may be responsible for the behavioral changes asociated to the alcoholism and mediated by TRH.
Resumen
Introducción. El enzima piroglutamato-aminopeptidasa (pGluAP) es una omega-peptidasa que libera residuos piroglutamilo N-terminales de péptidos y derivados arilamidas. Su actividad parece estar involucrada en la regulación de diferentes procesos fisiológicos en el sistema nervioso central, modificando distintos sustratos endógenos, en especial la hormona liberadora de tirotropina (TRH). Puesto que se sabe que la TRH juega un importante papel en la modulación de los cambios de comportamiento inducidos por el alcohol etílico y otras drogas, el presente trabajo se ha diseñado para estudiar el efecto in vitro del alcohol etílico (25, 50 y 100 mM) sobre la actividad del enzima pGluAP, y por tanto sobre su capacidad moduladora sobre dicho sustrato.Material y métodos. La actividad pGluAP se determinó en sinaptosomas obtenidos de cerebro de ratón, utilizando piroglutamil-ß-naftilamida como sustrato, tanto en condiciones basales como tras estimulación con K+ 25 mM, en un medio de incubación en presencia o ausencia de calcio.
Resultados. En condiciones basales, el etanol inhibe la actividad pGluAP tanto en presencia como en ausencia de calcio en el medio, no siendo esta inhibición dosis-relacionada. Sin embargo, la estimulación con K+ 25 mM no modifica la actividad pGluAP cuando el medio de incubación contiene calcio, pero la inhibe cuando el medio está libre de calcio. La despolarización en presencia o ausencia de calcio y etanol en el medio provoca una inhibición de la actividad pGluAP que varía en función de la dosis de etanol utilizada.
Conclusiones. El etanol modifica la actividad pGluAP en condiciones basales por un mecanismo calcio-independiente, si bien las variaciones obtenidas tras la estimulación con K+ sí ocurren por un mecanismo dependiente de calcio. Estas modificaciones de la actividad de la pGluAP debidas al etanol, y por tanto, sus efectos sobre sus sustratos endógenos (especialmente la TRH) podrían ser responsables en parte, de los cambios comportamentales asociados al alcoholismo y mediados por la TRH.
Introducción
El enzima piroglutamato-aminopeptidasa (pGluAP) es una omega-peptidasa que libera residuos piroglutamilo N-terminales de péptidos y derivados arilamidas. Su actividad parece estar involucrada en la regulación de diferentes procesos fisiológicos en el sistema nervioso central, modificando distintos sustratos endógenos, en especial la hormona liberadora de tirotropina (TRH). Puesto que se sabe que la TRH juega un importante papel en la modulación de los cambios de comportamiento inducidos por el alcohol etílico y otras drogas, el presente trabajo se ha diseñado para estudiar el efecto in vitro del alcohol etílico (25, 50 y 100 mM) sobre la actividad del enzima pGluAP, y por tanto sobre su capacidad moduladora sobre dicho sustrato.Material y métodos
Animales.Resultados
En los experimentos realizados en este estudio se han utilizado 22 ratones macho de la variedad Balb/C, con un peso medio de 28.7Å6.1 gramos.Los animales fueron proporcionados por el Estabulario de los Servicios Técnicos de la Universidad de Jaén y estuvieron acondicionados con un fotoperiodo día/noche de 12 horas, bajo condiciones constantes de temperatura (20-25ºC). Los animales dispusieron de comida y bebida ad libitum.
Obtención de la fracción de sinaptosomas.
La fracción de sinaptosomas utilizada en los diferentes experimentos realizados en el presente estudio se ha obtenido siguiendo el protocolo de Whittaker et al. (1984). Tras la muerte del animal por decapitación, se extrae el cerebro y se secciona la parte correspondiente a la corteza cerebral. El tejido obtenido, que se mantiene a 4°C durante todo el proceso, se homogeniza en sacarosa 0.32 M, utilizando un homogenizador de émbolo de teflón. El homogenado obtenido se centrifuga a 2.000 g y se recoge el sobrenadante. Este se centrifuga a 30.000 g. Se elimina el sobrenadante y el precipitado se resuspende en sacarosa 0.32 M. Este volumen se añade sobre un gradiente de densidad previamente preparado y se centrifuga a 30.000 g. Tras centrifugar, se elimina el sobrenadante y se recoge el precipitado que aparece en el centro del gradiente de densidad. El precipitado obtenido, correspondiente a la fracción sinaptosomal, se resuspende en medio de incubación con calcio o libre de él, dependiendo del protocolo seguido, ajustando el volumen para obtener una concentración final de proteína en la muestra de 0.1 mg/ml.Tras obtener la fracción sinaptosomal, se llevaron a cabo los siguientes protocolos experimentales:
* Incubación de los sinaptosomas en un medio de incubación con calcio o libre de calcio en condiciones basales, en presencia de etanol 25 mM, 50 mM y 100 mM.
* Incubación de los sinaptosomas en un medio de incubación con calcio o libre de calcio añadido de K+ 25 mM (condiciones despolarizantes).
* Incubación de los sinaptosomas en un medio de incubación con calcio o libre de calcio, añadido de K+ 25 mM (condiciones despolarizantes) en presencia de etanol 25 mM, 50 mM y 100 mM.Estas incubaciones se llevaron a cabo en un baño termostatizado a 37°C durante 15 minutos. Tras este tiempo, los sinaptosomas se centrifugan a 14.000 rpm, para eliminar del medio de incubación el K+ 25 mM y/o las distintas concentraciones de etanol utilizadas. Tras centrifugar, los sinaptosomas se resuspenden de nuevo en el medio de incubación con calcio o libre de calcio a 37°C. Los sinaptosomas así obtenidos se utilizarán para determinar la actividad de piroglutamato aminopeptidasa.
Determinación de la actividad piroglutamato aminopeptidasa.
La actividad piroglutamato aminopeptidasa (pGluAP) fue determinada frente al sustrato L-Piroglutamil- -naftilamida (pGluNNap), según el método de Schawe y McDonald (1977) con algunas modificaciones: a 20 l de la suspensión de sinaptosomas se añaden 50 l de la solución de sustrato conteniendo pGluNNap 100 M. Tras incubar durante 30 minutos a 37°C, se paran las reacciones con tampón acetato 0.1 M pH 4.2 conteniendo sal Fast Garnet GBC al 2%. La ß-naftilamina liberada como resultado de la actividad enzimática se acopla a la sal originando un compuesto rojizo que puede ser determinado espectrofotométricamente a una longitud de onda de 550 nm.
Las actividad enzimática específica de piroglutamato aminopeptidasa (pGluAP), se expresó en nanomoles de sustrato hidrolizado por minuto y por miligramo de proteína, utilizando una curva estándar de -naftilamina determinada en las mismas condiciones.Determinación de proteínas.
La determinación de proteínas se llevó a cabo por el método de Bradford (1976), utilizando una curva estándar de albúmina sérica bovina (BSA).Análisis estadístico.
Para estudiar el efecto producido por el etanol sobre los niveles basales o estimulados con K+ 25 mM sobre los diferentes parámetros estudiados, se ha utilizado un análisis de la varianza de una vía (ANOVA), seguido del test de rango múltiple de Newman-Keuls. Valores de P<0.05 se consideraron estadísticamente significativos.
El análisis de los efectos del etanol, en presencia o ausencia de calcio en el medio, sobre la actividad específica basal de pGluAP en sinaptosomas de corteza cerebral de ratón, muestra los siguientes resultados: El etanol, en presencia de calcio, provoca la inhibición de esta actividad enzimática (figura 1). Así, una concentración 25 mM de etanol provoca una inhibición significativa (p<0.01) del 45.68% con respecto al control. La concentración de etanol 50 mM provoca una disminución de la actividad pGluAP del 45.97% (p<0.01) y una concentración de etanol 100 mM provoca una inhibición del 55.87% (p<0.01) con respecto al control. En ausencia de calcio (figura 2), el etanol 25 mM provoca una inhibición significativa (p<0.01) de la actividad pGluAP del 49%. La concentración de etanol 50 mM inhibe en un 55.19% (p<0.01) y el etanol 100 mM provoca una inhibición significativa de esta actividad del orden del 46.28% con respecto al control (p<0.01).Discusión y conclusionesEl análisis de los efectos del etanol y la influencia del calcio en el medio de incubación sobre la actividad pGluAP tras la estimulación de los sinaptosomas con K+ 25 mM mostró los siguientes resultados: en presencia de calcio, el estímulo de los sinaptosomas con K+ 25 mM no provoca modificación alguna de los niveles de esta actividad (figura 3). En ausencia de calcio, el estímulo con K+ 25 mM disminuye significativamente la actividad pGluAP, en un 18.74% (p<0.01) (figura 4).
La incubación simultánea, en un medio con calcio, de los sinaptosomas con K+ 25 mM y etanol 25 mM (figura3) provoca una disminución significativa (p<0.01) de la pGluAP de un 43.75% con respecto al control. La presencia conjunta de K+ 25 mM y etanol 50 mM provoca una inhibición de la actividad en un 44.44% (p<0.01) con respecto a los valores controles. El estímulo de los sinaptosomas con K+ 25 mM en presencia de una concentración de etanol 100 mM provoca una disminución significativa (p<0.05) de los niveles de pGluAP del 7.54% con respecto al control (figura 3). En ausencia de calcio (figura 4), el estímulo de los sinaptosomas con K+ 25 mM en presencia de etanol 25 mM provoca una disminución significativa (p<0.01) del 8.06% con respecto al control. El estímulo de los sinaptosomas con K+ 25 mM en presencia de etanol 50 mM provoca una inhibición significativa (p<0.01) del 35.02% con respecto al control (figura 4). De la misma forma, concentraciones 100 mM de etanol bajo el estímulo de K+ 25 mM provoca una inhibición significativa (p<0.01) del 40.34%.
En el presente estudio se ha demostrado que el etanol tiene la capacidad de modificar la actividad del enzima pGluAP, provocando una inhibición de dicha actividad y siendo este proceso independiente de la presencia de calcio en el medio en condiciones basales. En condiciones estimulantes, esta actividad no sufre, en presencia de calcio en el medio, variaciones significativas con respecto a los valores control, si bien su actividad es menor cuando la estimulación con K+ 25 mM se lleva a cabo en un medio en ausencia de calcio. Por tanto, la estimulación provoca un comportamiento calcio-dependiente en la actividad de la pGluAP. Estas diferencias también son patentes cuando se administra etanol a diferentes dosis. Así, en presencia de calcio en el medio de incubación, el etanol provoca una inhibición inversamente proporcional a la concentración de etanol utilizada. Sin embargo, en ausencia de calcio en el medio, la inhibición inducida por el etanol es directamente proporcional a la concentración de etanol utilizada.BibliografíaEl enzima pGluAP se encuentra ámpliamente distribuido por los fluidos y tejidos corporales. Hasta la fecha, se han descrito tres formas distintas de la pGluAP. La pGluAP tipo I se localiza a nivel citosólico y presenta una amplia especificidad de sustrato, incluyendo la TRH, GnRH, neurotensina o bombesina entre otros. La pGluAP tipo II se ha descrito como un enzima de membrana muy específico para la neurohormona TRH. La tercera forma de pGluAP, denominada tiroliberinasa, aparece en el suero, y sus características bioquímicas son muy semejantes a las descritas para la pGluAP tipo II.
Aunque se conoce relativamente bien la acción hidrolítica de las distintas formas de pGluAP sobre los péptidos naturales o los substratos artificiales usualmente utilizados, el papel fisiológico que puedan tener estos enzimas no está bien definido. En el presente estudio se demuestra que la administración de etanol in vitro altera esta actividad enzimática, inhibiéndola, y que esta alteración es dependiente de los niveles de calcio en el medio. Se ha descrito que la administración intracerebral de péptidos relacionados con la pGluAP (neurotensina y bombesina) a ratones provoca un incremento en la duración del sueño provocado por la ingesta de etanol, e incluso resaltan la hipotermia provocada por la ingesta de alcohol. Los presentes resultados demuestran, por tanto, que los neuropéptidos pueden estar implicados en los complejos mecanismos de acción del etanol sobre el sistema nervioso central, y que esta participación puede estar mediada por las modificaciones inducidas en los sistemas enzimáticos encargados de regular la actividad de dichos neuropéptidos, actuando a nivel de sus procesos degradativos.
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Figura 1. Representación del efecto del etanol a concentraciones 25 mM, 50 mM y 100 mM sobre la actividad específica basal de piroglutamato aminopeptidasa en sinaptosomas de corteza frontal de ratón, incubados en presencia de calcio en el medio de incubación. Los resultados se expresan en nanomoles de piroglutamato-ß-naftilamida hidrolizados por minuto y por miligramo de proteína (MediaÅSEM; n=11; **p<0.01).
Figura 2. Representación del efecto del etanol a concentraciones 25 mM, 50 mM y 100 mM sobre la actividad específica basal de piroglutamato aminopeptidasa en sinaptosomas de corteza frontal de ratón, incubados en ausencia de calcio en el medio de incubación. Los resultados se expresan en nanomoles de piroglutamato-ß-naftilamida hidrolizados por minuto y por miligramo de proteína (MediaÅSEM; n=11; **p<0.01).
Figura 3. Representación del efecto del etanol a concentraciones 25 mM, 50 mM y 100 mM sobre la actividad específica de piroglutamato aminopeptidasa en sinaptosomas de corteza frontal de ratón estimulados con K+ 25 mM, incubados en presencia de calcio en el medio de incubación. Los resultados se expresan en nanomoles de piroglutamato-ß-naftilamida hidrolizados por minuto y por miligramo de proteína (MediaÅSEM; n=11; *p<0.05, **p<0.01).
Figura 4. Representación del efecto del etanol a concentraciones 25 mM, 50 mM y 100 mM sobre la actividad específica de piroglutamato aminopeptidasa en sinaptosomas de corteza frontal de ratón estimulados con K+ 25 mM, incubados en ausencia de calcio en el medio de incubación. Los resultados se expresan en nanomoles de piroglutamato-ß-naftilamida hidrolizados por minuto y por miligramo de proteína (MediaÅSEM; n=11; **p<0.01).
