La piel es el órgano más extenso del cuerpo, y por lo tanto recibe la mayoría de los antígenos ya sea en forma ambiental o tópica. Es por ello que ha desarrollado un sistema inmune muy competente por medio del cual, contiene o neutraliza a la mayoría de las noxas. El Eczema de Contacto es una entidad muy frecuente en la práctica clínica dermatológica, con lesiones recidivantes debido al contacto permanente con antígenos. Esto conduce a un estado de cronicidad con episodios recurrentes que ocasionan prurito y malestar psico-físico. Esta entidad está mediada por una multiplicidad de moléculas que amplifican la respuesta inflamatoria e inmunológica, algunas de las cuales están producidas por queratinocitos, Células de Langerhans y endoteliales, interaccionando todas ellas con la matriz extracelular.
Material y métodos
Se estudiaron 14 pacientes de ambos sexos, diagnosticados clínicamente como portadores de Eczema por Contacto vinculados con su actividad laboral. Para la detección del Antígeno contactante, se aplicaron parches cutáneos, efectuándose la lectura en distintos tiempos y obteniéndose biopsias de las lesiones primarias y las inducidas por parches. Los especímenes fueron estudiados por Microscopía Optica, High Resolution Light Microscopy (HRLM) e Inmunohistoquímica.
Resultados
Los hallazgos histológicos mostraron un espectro variable en cuanto al tiempo evolutivo: desde espongiosis y vesículas en los casos agudos, hasta cambios crónicos representados por hiperqueratosis. Por medio de HRLM se visualizó con una mayor resolución los diferentes componentes morfológicos de las estructuras estudiadas, siendo relevantes las alteraciones en los es desmosomas, con aumento del espacio intercelular y el infiltrado inflamatorio a predominio mononuclear. A nivel Inmunohistoquímico, se pudo caracterizar el fenotipo de las células inflamatorias y algunas moléculas de adhesión intervinientes en este proceso.
Conclusión
La interacción de diferentes disciplinas, fue fundamental para reconocer algunos de los eventos fisiopatogénicos que se producen en esta entidad.
Palabra clave
ECZEMA - CLINICA - MO - HRLM -INMUNOHISTOQUIMICA
Bibliografía
El Eczema por Contacto, también denominado Dermatitis por Contacto es una patología
frecuente en la consulta dermatológica. (1-2-3-4-5-6-7)
Es una entidad que ocasiona un fuerte impacto socio-económico, ya que en general él o los antígenos que provocan el Eczema, constituyen habitualmente la herramienta laboral de los pacientes. La piel, es un órgano muy extenso y envolvente, por el cual penetra la mayoría de los antígenos ya sea en forma ambiental o tópica, por lo cual ha desarrollado un Sistema Inmune muy competente (SIP). El mismo, responde ante los diferentes antígenos que penetran, por medio de distintas células y moléculas que no sólo tratan de contener al antígeno, sino que también amplifican la respuesta inflamatoria.(1-8-9-10-11-12)
Debido a la gran cantidad de células y sustancias involucradas y a la diversidad de antígenos, muchos de los eventos fisiopatogénicos del Eczema por Contacto se desconocen.( 1-13)
Es por esto que, en la práctica médica esta entidad se resuelve en forma sintomática, con medicación corticoidea y antripruriginosa, lo que no termina de resolver el problema, ya que las lesiones recidivan, o se tornan crónicas por el permanente contacto con el antígeno.
El objetivo general de este trabajo, fue tratar de analizar y reconocer algunos de los eventos fisiopatogénicos que se producen en la respuesta inflamatoria en el Eczema por Contacto, por medio de diferentes técnicas.
El Universo estudiado correspondió a 14 pacientes, diagnosticados clínica y
epidemiológicamente como portadores de Eczema por Contacto.
Se realizó un Protocolo de Estudio de los pacientes, el cual consistió en aceptación
por escrito de su participación en el Proyecto de Estudio sobre Eczema por Contacto.
En el mismo se les comunicaba que se iba a aplicar parches cutáneos en la espalda
y posteriormente debían regresar para la lectura de los mismos a las 48 y a
las 96 hs. (Fig Nº1). Se les explicó que
se les realizarían tomas biópsicas de la lesión primaria y una toma de la reacción
más intensa de aquellas provocadas por la colocación de parches cutáneos.
Se realizaron estudios Clínicos y epidemiológicos de estos pacientes, observándose las lesiones primarias y a posteriori las lesiones secundarias a la colocación de los parches. Metodología para la utilización de los parches: Siguiendo el Protocolo sugerido por el Grupo Internacional de Investigaciones en Dermatitis de Contacto (ICDRG), se utilizó Batería Standard MARTI TOR (Barcelona España). El Método de aplicación de parches fue Al Test (IMECO- Suecia). Los antígenos contenidos en la Batería fueron: cloruro de cobalto, colofonio, dicromato de potasio, sulfato de níquel, parabenos, resinas epoxi, sulfato de neomicina, mezcla de thiurán, thiomersal, mercurio, aldehído cinámico, parafenilendiamina, clorhidrato de benzalconio, alcoholes de lana, bálsamo de Perú, etilendiamina, mezcla de PPD, breas de madera, mezcla carba, y mezcla de perfumes. La lectura de los parches se realizó a las 48hs, a las 96 hs, y a los 7 días.
La valoración clínica de la reacción producida por la aplicación de los parches se midió en cruces: eritema: +, eritema con formación de vesículas: ++, reacción vesiculosa intensa y/o ampollosa: +++.
Para el estudio histopatológico se tomaron biopsias de las lesiones primarias de mano y antebrazo y de la zona escapular donde se habían colocado los parches. Este procedimiento se realizó con el fin de poder valorar las lesiones propias del paciente y aquellas desafiadas por los antígenos. Las muestras obtenidas de las lesiones secundarias correspondieron a aquellas en donde la reacción se presentaba en forma más intensa. En ningún caso, la lesión provocada sobrepasó los límites establecidos por el parche.
Cada espécimen fue dividido a su vez en dos fragmentos, los cuales fueron empleados para Microscopía Optica e Inmunocitoquímica y para Microscopía de Alta Resolución (MOAR) o High Resolution Light Microscopy (HRLM).
Para el estudio histopatológico los especímenes fueron fijados en formol al 10% durante 12 hs, incluidos en parafina y teñidos con Hematoxilina -Eosina. Para el Estudio Inmunohistoquímico, los materiales fueron desparafinados con xilol durante 15 min. Posteriormente se los hidrató en alcoholes de graduación decreciente (100º, 96º, 75º) y agua bidestilada durante 10 min.
Para la recuperación antigénica fueron sumergidos en solución citratada (DAKO) en baño María, durante 20 min. A posteriori, los especímenes fueron dejados a temperatura ambiente y se lavaron en PBS (Fosfato Buffer Salino) a PH 7,6 durante 20 min. La peroxidasa endógena fue bloqueada con agua oxigenada (SIGMA) al 3% durante 5 min. y seguidamente lavados exhaustivamente con PBS. Posteriormente fueron incubados con PBS- Albúmina bovina (SIGMA) al 3% durante 20 min. para bloquear sitios inespecíficos que pudiesen originar falsas marcaciones. Se los incubó con los anticuerpos primarios correspondientes durante 30 min. en cámara húmeda a temperatura ambiente, utilizándose diferentes diluciones.
Los anticuerpos monoclonales ratón anti-humano (CYTEL CORPORATION) utilizados fueron: CD1a (cél. de Langerhans, cél. dendríticas y timocitos); CD3 (linfocitos T); CD45RO (p180, linfocitos T de memoria); CD45RA (p220, leucocitos); CD 25 (Cad. a del receptor de IL-2, linfocitos T activados); CD15s (Sialil Lewis, en granulocitos, cél. NK, linfocitos T y B activados y monocitos) y CD49d (Cadena a4 de VLA-4, b1 integrina, que se expresa en leucocitos activados). Los anticuerpos secundarios pertenecieron al Kit EXTRA-2 (SIGMA).
El revelado de los materiales se realizó con DAB (SIGMA FAST), Diaminobencidina con metal resaltador en tabletas (que produce un color azul cobalto), deteniendo la reacción con agua bidestilada y realizándose el contraste con verde de malaquita. En algunos casos se utilizó el DAB sin metal que produce una marcación de color marrón, obteniéndose el contraste con Hematoxilina. Los materiales que se utilizaron para HRLM se fijaron en glutaraldehído-paraformaldehído a PH 7,2 enfriado durante 48 hs. El material fue lavado en buffer collidina, deshidratado con acetona de concentraciones crecientes y refijado en tetróxido de osmio. Luego fueron pre-incluídos en partes iguales de acetona y plástico Araldita (Lab. Polysciences) y posteriormente incluídos en Araldita, polimerizando a las 48 hs. Las secciones de estos materiales fueron obtenidas con un Ultramicrótomo Porter Blum MT1 y su espesor fue de aproximadamente 0,5 a 1 micra. Las mismas fueron coloreadas con fucsina básica, azul de toluidina y la mezcla de ambos colorantes.
Los pacientes involucrados fueron de ambos sexos y su rango de edad osciló entre los 17 y 68 años. Con respecto a la actividad laboral, 7 de ellos realizaban tareas relacionadas con la construcción, fundamentalmente albañilería, 4 pacientes en tareas domésticas, 1 paciente relacionado con maderas y productos químicos utilizados en su manufacturación, 1 guardia de seguridad que estaba en contacto con materiales derivados de la construcción, y uno solo de ellos realizaba tareas de tipo administrativo.
En los 14 pacientes, existía una sospecha clínica del antígeno involucrado en el proceso inflamatorio. Los resultados mostraron concordancia con la clínica.
OBSERVACIONES CLINICAS
En ambos tipos de lesiones, Primarias y Secundarias, los síntomas predominantes fueron el prurito y el dolor, los cuales aumentaban si se acompañaban de infección.
Aquellos pacientes que estaban en contacto con productos de albañilería, presentaron lesiones múltiples en diferentes estadíos evolutivos en diversas regiones corporales, principalmente en manos. (Fig. Nº 2)
En las lesiones primarias, la signo-sintomatología primordial fueron: máculas, pápulas y/o vesículas. En ocasiones las máculas se tornaban coalescentes, lo cual originaba placas de aspecto eritematoso con marcado edema. Inicialmente se observó que las lesiones estaban confinadas al lugar del contacto y variaban en extensión de acuerdo a la intensidad o grado de exposición al antígeno.
OBSERVACIONES HISTOPATOLOGICAS
Los materiales correspondientes a lesiones crónicas, mostraron grados variables de hiperqueratosis y acantosis irregular. En aquellos donde se observaba una reagudización de las mismas, fue relevante la aparición de vesículas localizadas en la región malpighiana (Fig Nº3). La dermis papilar subyacente presentó dilatación de las estructuras capilares y abundantes células de estirpe mononuclear predominantemente perivascular.
En biopsias de lesión provocada por parches, la espongiosis intraepitelial fue más marcada que las lesiones primarias, con formación de vesículas grandes, las cuales presentaban múltiples tabicaciones. En dermis papilar, se observó infiltrado inflamatorio a predominio mononuclear.
OBSERVACIONES POR MEDIO DE HRLM
A nivel de epidermis, se observó espongiosis de grado moderado, pero llamó la atención la separación de los elementos epiteliales. Los desmosomas se presentaban con una disposición alargada, lo cual aumentaba visiblemente la separación intercelular.
En la capa basal se observó una hiperactividad del epitelio con nucleólos prominentes. Dentro del citoplasma de las células basales se observaron vacuolas de diferente tamaño. En la capa espinosa, la espongiosis se tornaba confluente, existiendo ruptura de los desmosomas.
Más superficialmente, en la capa espinosa, las vesículas se encontraban totalmente formadas, limitadas por pequeños tabiques muy delgados, que correspondían a membranas basales de queratinocitos adyacentes. En algunos de los materiales se observó la presencia a nivel suprabasal de Células de Langerhans, y en otros, migrando hacia la dermis subyacente. (Fig. Nº4)
A nivel dérmico, se observó un infiltrado a predominio linfocitario, el cual se ubicaba a nivel perivascular. Las células endoteliales se presentaron tumefactas, disminuyendo la luz del capilar. En la matriz extracelular, tanto las fibras de colágeno como las elásticas, se distribuían en forma anárquica y/o arremolinadas. Ocasionalmente se observó pérdida de la periodicidad en las fibras de colágeno.
OBSERVACIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS
La Inmunomarcación con los diferentes anticuerpos permitió tipificar los distintos componentes celulares que caracterizan estas lesiones. Las Cél. de Langerhans se identificaron predominantemente con el anticuerpo anti CD1a en la zona suprabasal (Fig. N° 5).
Pudo comprobarse que el infiltrado inflamatorio tanto en biopsias de lesiones primarias y secundarias fue destacadamente de tipo T, ya que la celularidad se inmunomarcó con CD3 (Figs. N° 6 y 7).
En lesiones evolucionadas pudimos encontrar escasas células infiltrando el epitelio positivas para CD45RA (p220) (Fig. N° 8). Los linfocitos T de memoria (CD45RO-p180 positivas) conformando bandas en el corion y en ocasiones traspasando el epitelio, se mostraron en forma abundante sobre todo en lesiones provocadas (Fig. 9 y 10). Asimismo, pudimos observar que los linfocitos T que se encuentran infiltrando, son linfocitos T activados ya que expresaron CD25 en su superficie (Fig. N° 11 y 12). Esta activación linfocitaria pudo confirmarse con la expresión de la cadena a4 del VLA-4 (CD49d, b1 integrina), en los elementos celulares próximos a las vesículas (Fig. N° 13 y 14).
Por último, la expresión del antígeno Sialil Lewis fue positiva en escasas células en el corion papilar (Fig. N° 15 y 16).
La combinación de diferentes técnicas utilizadas para la observación de los materiales obtenidos de pacientes con Eczema por Contacto, permitieron dilucidar algunos de los eventos fisiopatogénicos de la enfermedad, aportando por lo tanto, una mayor comprensión de esta entidad. Además la interacción entre la Patología convencional, la Subcelular por medio de HRLM y el reconocimiento de las moléculas intervinientes por medio de la Inmunocitoquímica, permitió un mayor acercamiento entre diferentes disciplinas y definir futuras estrategias de estudio.
La histopatología no puede ir más allá de los aspectos estructurales que aparecen en estas lesiones, por lo que no puede diferenciar entre los diferentes eczemas. La HRLM, es una técnica que debido a la calidad de su fijación y la inclusión en resinas plásticas que permiten realizar cortes de 0,5 a 1 micra, otorga una significativa visualización de las estructuras a estudiar (15-16). Permite con un microscopio óptico acceder a la observación de estructuras subcelulares, tales como gránulos, microvellosidades, depósitos de inmunocomplejos, etc. Además, ya que no necesita del microscopio electrónico -instrumento que no siempre está al alcance del patólogo práctico- para ser observado, disminuye costos y tiempos. Así se observó que existe una clara desorganización del anclaje celular y una importante intervención del Sistema Inmune de Piel (1) y de la respuesta inflamatoria por la identificación adecuada de los elementos celulares. La tumefacción de las células endoteliales fue muy evidente así como las características de las células infiltrantes.
La Inmunocitoquímica permitió no solo la tipificación de las mismas, sino también nos ayudó a la comprensión de los mecanismos utilizados por las células para el desencadenamiento y perpetuación de la enfermedad.
El Eczema por Contacto, a pesar de ser una entidad frecuente en la práctica médica diaria, no posee aún una clara resolución de muchas de sus incógnitas. Esto es debido no sólo a la gran cantidad de antígenos que están presentes en el medio externo, sino también al gran número de moléculas intervinientes en el proceso inflamatorio (12-13-14-15).
Además existen otros problemas en esta patología, tales como: el mal estado psicofísico del paciente, y la medicación corticoidea que, a pesar de sus efectos beneficiosos transitorios, no termina de resolver el problema (5-8-9).
Es por todo esto que el estudio sistemático e interdisciplinario, permitirá en un futuro, reconocer y poder manejar y prevenir de una manera racional e integradora esta enfermedad.
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Fig. N° 4: Puede percibirse incremento del espacio intercelular debido a las alteraciones que sufren los desmosomas. En sección de papila, se observa célula de Langerhans. En el corion, vaso con endotelio hipertrófico y células inflamatorias de tipo mononuclear. MOAR. Azul de toluidina y fucsina básica. 400X |
Silvia Frede 1, Andrea Martín 2, Susana Ortiz 3, María de Cabalier 4, Ernesto Hliba 5, María Serra 6 y Horacio Serra 7.
Todos los integrantes pertenecen a la Universidad Nacional de Córdoba - Argentina.
Este trabajo fue parcialmente subsidiado por SECyT (Secretaría de Ciencia y
Técnica) de la Universidad Nacional de Córdoba.
